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(無題) 削除/引用 No.2778-13 - 2014/02/04 (火) 18:12:29 - 名無し うちはHEK293Tくっつけたい時はコラーゲンよりもポリLリジンつかってるけどなぁ。 35mmディッシュとか小さいディッシュなら、ポンプで吸引するタイプのアスピレーターは強すぎて剥がれてしまうから、マイクロピペッター（1000μl）でゆっくり吸って排液してる。

(無題) 削除/引用 No.2778-12 - 2014/02/01 (土) 11:31:03 - transduction コラーゲンコートなりで接着性を高めるのは手だと思います。 もしそれでも上手くいかない場合は、細胞株を別のもの(若いのや他のうまくいってる研究者からもらう)等に換えるのがよさそうですかねぇ。

(無題) 削除/引用 No.2778-11 - 2014/02/01 (土) 09:54:48 - モモ トランスフェクションの2日前に細胞をまいておくとはがれにくいですよ。

(無題) 削除/引用 No.2778-10 - 2014/01/29 (水) 12:44:18 - mon ウィルス産生では行ったことはありませんが、 293細胞の免疫染色時に剥がれるのを抑制する目的で、PEIコート(PLLより安価だから）後さらにコラーゲンコートを行ったことはあります。PEIコートのみより接着はやや強かった印象が残っています。 （PEI残液は毒性が強いのでリンスを必ず行ってください） MPさんが仰るようのウィルスタイターが上がるなら行ってみようかな。情報ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2778-9 - 2014/01/29 (水) 10:24:25 - れんち みなさま、コメントありがとうございます。 むーさん もちろん自分自身の操作に関しては仰る通り、ゆっくり壁伝いに注いでいます。 培地をポタポタと上から垂らすような操作はしていません。 MPさん ポリLリジンもしくはコラーゲンコートし一度検討して見ます。 どうもありがとうございます。 qqさん そちらに関してはやるつもりはありません。 一般的な手法ではなさそうですので。

(無題) 削除/引用 No.2778-8 - 2014/01/29 (水) 09:44:26 - qq 当たり前の事ですが、ビタミンC（リン酸化アスコルビン酸）を20uM程度supplementすると、ヒト細胞は接着を増します。まあ、やるかやらないかは、自己責任です。

(無題) 削除/引用 No.2778-7 - 2014/01/28 (火) 19:41:34 - MP poly L-lysineをコートして使っています。多少接着性が上がるかなという程度ですが、ウイルスタイターは明らかに高くなります。詳しいプロトコールは理研BRCのホームページにあったはずです。

(無題) 削除/引用 No.2778-6 - 2014/01/28 (火) 19:30:39 - むー 培地をディッシュの壁を伝わらせるようにゆっくり加えればかなり剥がれにくくなるはずです 293Tはど真ん中にぽたぽた培地をたらすとそれだけで剥がれるくらい弱いので気を付けてください。たとえコラーゲンコートだろうが剥がれるときは剥がれます

(無題) 削除/引用 No.2778-5 - 2014/01/28 (火) 16:53:32 - れんち momさん 詳しく教えてくださり本当にありがとうございます。 次回のレンチウイルス作成より、momさんにお教えいただいたコラーゲンコートディッシュを使ってみます。 本当にありがとうございました。

手抜きコラーゲンコート法 削除/引用 No.2778-4 - 2014/01/28 (火) 16:45:46 - mon れんちさん コラーゲンコートdishは高価なので、TOYOBOのコラーゲンコート溶液を使っています。 http://www.bio.toyobo.co.jp/bio01/file/TMTCC-050.pdf 特にこだわりはなく、調べた中では一番安価だったので選んでいます。 使用法に関して、「293(T)細胞の場合」思いっきり手を抜いています。 具体的には、10cm dishの底面が浸る程度の溶液(3~5mL)を加え、なじませます。 dishを傾けたとき液が弾かないようになればOK（〜1分）。 できる限り溶液を回収し、風乾させそのまま使用しています。 多少の残液は増殖等に影響がないようです。 回収液は無くなるまで継ぎ足すように使用しています（コンタミを心配して5回ほどで捨てていますけど）。 なお、接着がシビアな細胞にはマニュアル通りの方法をお薦めします。

(無題) 削除/引用 No.2778-3 - 2014/01/28 (火) 16:10:28 - れんち momさん 遺伝子導入はlipofectamineLTXで行っていますが、IRESによるGFPの発現が全部の細胞で見られますので遺伝子導入に関しては問題ないかと思います。 LTXをかけた後の培地交換時に剥がれやすいことと、 遺伝子導入後に細胞が浮いてくるのは仕方ないことなのか、 それとも私自身の手法に問題ありなのか知りたい次第であります。 momさんの仰る「約80%コンフルエントほどで遺伝子導入しすると、導入後2〜3日ではギシギシになっています」に関してはコラーゲンコートで飼っているため293Tが剥がれにくい結果、細胞がどんどん増えていくのかと思いました。 是非試させていただきたいと思います。 もしよろしければmomさんが作成しているコラーゲンコートの手法についてもご教授いただければ大変助かります（ネットなどで探せばいくらでも出てくるかとは思いますが…）。

(無題) 削除/引用 No.2778-2 - 2014/01/28 (火) 14:48:31 - mon 約80%コンフルエントほどで遺伝子導入しすると、導入後2〜3日ではギシギシになっていますが死んではいませんよ。 遺伝子導入か培地に問題がありそうですが？ なお、293Tの培養に関して、普段は通常の接着細胞用dishで、遺伝子導入時には細胞が剥がれずらいコラーゲンコートディッシュ(自作）を使用しています。

レンチウイルス作成時の293Tについて 削除/引用 No.2778-1 - 2014/01/28 (火) 13:51:38 - れんち 詳しい方ご教授ください。 レンチウイルスベクターを作る際に293Tを使用しますが、 培地交換するだけでもペラペラ剥がれてきてしまいます。 パッケージングと共にレンチ用ベクターをトランスフェクションしたあと２，３日飼いますがトランスフェクション前（約８０-９０％コンフル）と比べて細胞が死んでしまいます。トランスフェクション後約２日目で大体５０−６０％くらいの細胞になってしまっています。 こういった場合皆さんはどう対処していますでしょうか？ コラーゲンコートディッシュを使用するなど細胞が死なない、はがれにくくする方法はどういったものがありますでしょうか？ 皆様ご教授お願いします。

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