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(無題) 削除/引用 No.2775-17 - 2014/01/31 (金) 08:59:25 - tri >[Re:15] fat+reseracherさんは書きました : > では、やはりtop側を取り除くということで良いんですね。triさんの訂正の仰るところは、その取り除く層は透明ではない(多分白く濁っている?)ということでよいのでしょうか? 何を思ったか、chloroformを入れた後の遠心後を想像してしまい、「透明」と書いてしまいました。 実際に行っている人間ではないのにコメントするのは申し訳ないのですが、少なくとも赤ではないので、区別がつくのだろうと思います。 > Removeって単語から私が最初に考えるのは"捨てる"とか"除去する"ですが、"移動する"の意でも使われるんですね。こういう場合transfer使って欲しい... removeは、その場所から「取り除く」という意味合いで、必ずしも「捨てる」と直結するわけではないのかな、と思います。なので、チューブから「remove」して、新しいチューブに「tranfer」する、という記載になるのでしょうね。きっと、「捨てる」なら「discard」とか書きそうです。まあ、好みの問題もあると思います。 トピ主さんが新しく採用されたということは、ラボの運営上の問題ではないと思いますが、グラントとれないからラボ閉鎖かポスドク解雇、とか言う話も最近耳にします。もちろん、猶予期間はあるのですが、突然そんなこと言われたら焦りますよね。 同僚の方も大変だと思いますが、猶予期間内に就職先が見つかるといいですね。

(無題) 削除/引用 No.2775-16 - 2014/01/31 (金) 04:04:06 - fat+reseracher >triさん 当方、そのアメリカにおります。確かにどこも厳しいですね。ただまあ、うちの大学だと(?)普通は契約は年単位で行われていて、この問題の同僚も契約が更新されないという形でのクビなので、ある意味"急にクビ"という訳ではないとも言えます。私がこのラボに来るのが決まったのは3ヶ月前の話で、その時にボスから通達があったそうですし。来週別のラボを訪ねて面接を受けてくるそうなので、就職が無事に決まる->私にも優しくなるのコンボが起こると良いなと思います。

(無題) 削除/引用 No.2775-15 - 2014/01/31 (金) 03:55:11 - fat+reseracher >triさん、APさん では、やはりtop側を取り除くということで良いんですね。triさんの訂正の仰るところは、その取り除く層は透明ではない(多分白く濁っている?)ということでよいのでしょうか? Removeって単語から私が最初に考えるのは"捨てる"とか"除去する"ですが、"移動する"の意でも使われるんですね。こういう場合transfer使って欲しい...

(無題) 削除/引用 No.2775-14 - 2014/01/30 (木) 12:16:10 - tri >[Re:10] fat+reseracherさんは書きました : > >APさん > 下段のコメントの意味するところがよくわからないのですが、ようするに"トピ主もその同僚もlipidとfatの違いすらわかってないんだろう"ということでしょうか? "そのかたも" の "も" はトピ主にかかっているんですよね? たぶん、私に対してだと思います。 海外だと、急にクビにされる話はよく聞きますね。 特に、最近アメリカでもグラントとれないラボが増えてきているようですし。

(無題) 削除/引用 No.2775-13 - 2014/01/30 (木) 10:22:12 - AP Trizolの説明書 http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_J_12_Jun_2007_1.pdf にも、こう書いてありました。 --------------------------------------------------------------- オプション:筋肉、脂肪組織および植物の塊茎部のような、タンパク質、脂肪、多糖類または細胞外物質を 大量に含むサンプルは、さらに分離ステップが必要な場合があります。この場合、ホモジナイズ後、遠心分 離(12000g, 10 分、2°Cから 8°C)により不溶性画分を除去してください。細胞外膜、多糖類および高分子量 の DNA は沈澱し、RNA は上清に含まれています。脂肪組織からの検体は、上層に脂肪成分がみられるこ とがありますので除去してください。得られた RNA 溶液は、新しい RNase free のチューブに移し、クロロホ ルムを添加し、以下のプロトコールへ進んでください。

(無題) 削除/引用 No.2775-12 - 2014/01/30 (木) 10:01:22 - AP >2) APさんの"debrisを遠心で落として取り除く"ということであればbottom側を取り除く(top側の層を新しいチューブに移してこれを使う) ごめんなさい。 よく読んだら、lower phaseを新しいチューブに移せと書いてあったわ。

(無題) 削除/引用 No.2775-11 - 2014/01/30 (木) 09:34:43 - fat+reseracher >monさん TRIzol組成って公表されてるんですね。知りませんでした。ありがとうございます。 これによると、フェノール含有量は1ml中に約0.4mlですね。ということは、私が加えたクロロフォルムとほぼ等量。。。

(無題) 削除/引用 No.2775-10 - 2014/01/30 (木) 09:21:25 - fat+reseracher >triさん、APさん まだその後に実験を出来ていないのですが、結局遠心後に取り除くのはチューブのtop側なのかbottom側なのかどっちなんでしょう? 1) triさんの話ではtop側に不溶性の脂肪分がくるのでこれを取り除く、 2) APさんの"debrisを遠心で落として取り除く"ということであればbottom側を取り除く(top側の層を新しいチューブに移してこれを使う) ということになると思いますが、どっちでしょう? 私の場合では、triさんのコメントが的を得ていて、top側を取り除くのだと思っております。ホモジェナイズしきれないdebrisを取り除くのは別の臓器でやったことがありますが、今回の私の場合(白色脂肪)では当てはまらないように思います。 確かにtriさんの二つ目のリンクには in order to separate the insoluble fat materialとあって、次のステップでRemove the cleared homogenate (lower phase) とありますね。しかし、これ、このcleared homogenate (lower phase) に対してクロロフォルムを入れろと書いてますね(ステップ8の書き方からみても)。捨て去るわけではなくて。なので、結局取り除くのはtop側ということですよね。 別ページ http://www.utm.utoronto.ca/~w3flyma/protocols/Trizol%20Troubleshooting.pdf では、トラブルシューティングに Centrifuge sample before chloroform addition and remove fat layer on top とあって、これはわかりやすくtop側にfat layerが来るとありますね。 >APさん 下段のコメントの意味するところがよくわからないのですが、ようするに"トピ主もその同僚もlipidとfatの違いすらわかってないんだろう"ということでしょうか? "そのかたも" の "も" はトピ主にかかっているんですよね? 自己弁護の為に書きますが、私自身はlipidとfatの違いは一応わかっているつもりで、lipidからRNAが回収できたりはしないことはわかっております。ところが同僚は"脂質中のRNA"と言ってるわけで(英語でlipidでした。それを反映して"脂質"と書いてます)、それで、クビになるのはあなたの知識不足のせい、私のせいじゃないよ、のつもりで書いたんです。わかりにくかったですかね?それとも、私のコメントから、致命的にわかってないなと判断できるところがあるんでしょうか?もしそうでしたら後学のために教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2775-9 - 2014/01/30 (木) 08:47:22 - tri 訂正します。 「透明な」脂質の層、と書いたのは間違いですね。 フェノール相の方が透明（赤色はついてるけど）だと思います。 いずれにしても、上層を除く事に変わりはないです。

TRIzol組成 削除/引用 No.2775-8 - 2014/01/29 (水) 12:50:16 - mon 失礼しました。間違って投稿してしまいました。 特許明細(US5346994)によるとTRIzol組成は以下のようですね。 0.8M Guanidium Thiocyanate 0.4M Ammonium Thiocyanate 0.1M Sodium Acetate (pH5.0) 5%(v/v) glycerol 38%(v/v) phenol + Dye (oil red?) だれか試した方いないかな？

TRIxol 削除/引用 No.2775-7 - 2014/01/29 (水) 12:46:22 - mon

(無題) 削除/引用 No.2775-6 - 2014/01/29 (水) 11:35:28 - tri >[Re:5] APさんは書きました : > リンク先のプロトコールで、クロロフォルムを加える前に遠心するというのは、insolble fat materialsを除くためと書いてあり、それで脂質（fat, lipid）を取り除くとは書いてませんでしょう。要はfat (脂肪組織、脂身）のdebrisを遠心で落として取り除くということです。これは脂肪組織に限らず、他の材料でもよくやる手順です。 少し誤解があるようですが、Chloroformを入れる前に遠心すると、脂肪はフェノール相の上に透明な層をつくるので、不溶性の脂肪分を除けるということです。 もちろん、多糖類が多い組織とかタンパク質含量が多い組織だと、遠心して沈殿物を取り除くことはありますが、ちょっと意味合いが異なりますよ。

(無題) 削除/引用 No.2775-5 - 2014/01/29 (水) 10:48:37 - AP リンク先のプロトコールで、クロロフォルムを加える前に遠心するというのは、insolble fat materialsを除くためと書いてあり、それで脂質（fat, lipid）を取り除くとは書いてませんでしょう。要はfat (脂肪組織、脂身）のdebrisを遠心で落として取り除くということです。これは脂肪組織に限らず、他の材料でもよくやる手順です。 >"脂質を先に除いたら、脂質中のRNAを捨てることになるでしょ!なんの為に脂肪組織を調べてるかわかってるのか?" そのかたも、fatとlipidの意味するところの違い、つまり脂肪組織と脂質の違いがわかっていないんでしょうな。 fat（脂肪組織）のなかにはもちろんRNAがあるけれど、それをlysisした内容物であるlipidやdebriにはRNAは含まれない（そういうものたちからRNAを抽出する操作をしているのだ）ということ、理解しているのでしょうか。

triさん、monさん、コメントありがとうございます。 削除/引用 No.2775-4 - 2014/01/29 (水) 01:41:19 - fat+reseracher triさん、きちんと説明書に遠心して脂質を除くとあるのですね。なぜか見逃していました。ありがとうございます。次回はこれを試してみようと思います。 リンク先の説明では、クロロフォルムが1:1の場合にはDNAのコンタミネーションの可能性あり、その一方でRNAの回収率が最大になることも見込まれるとありますね。cDNA合成の際、逆転写酵素抜きのチューブを一本作っているのですが、これでは全くバンドが見られなかったので、DNAのコンタミは今回の私の場合では無視できるレベルなのかと思います。次回遠心して脂質を除いてからのRNA抽出を試してみて、回収率の違いをみてから、どちらの方法(クロロフォルム0.4ml 又は まず遠心で脂質を除く)でいくか決めようと思います。場合によっては、遠心で脂質を除いてからクロロフォルム0.4mlもありかもしれません。 monさんと同じく、どのみちTRIZolだけではDNAのコンタミは避け得ないと私も思いますので、回収率とコンタミのトレードオフを考えながら実験していこうと思います。残念ながらそれほど資金の潤沢なラボでは無いので、TRIZolの二回使いはちょっと難しいです。仰る通り、最終的には脂質のほとんどは除けていると思います。 同僚に関して、まさにこのトピを上げた直後に、別の同僚から"なんか絡まれてるみたいだけど、君が来たことでクビが確定したためだから、流しとけばいいよ"とのことでした。それでも、せっかくなのでトピで教えて頂いたことを伝えようと話してみたところ、"脂質を先に除いたら、脂質中のRNAを捨てることになるでしょ!なんの為に脂肪組織を調べてるかわかってるのか?"とのことでした。...マジですか...クビになるのは私のせいじゃないよ。。。

(無題) 削除/引用 No.2775-3 - 2014/01/28 (火) 10:56:11 - mon 気になるなら一回目はクロロフォルムを多めに入れ、RNA沈殿をDDW等に溶かしたあと、TRIzolを加え通常のクロロフォルム量で抽出すれば良いと思います。 どのみちTRIzolだけで完全にDNAを除けないですし。 また脂質はOD260/280に影響しない（と思う）ので、混入していても分からないと思います。 もっとも、Isopropanol沈殿時に上清となって大部分除去できるとは思います。

(無題) 削除/引用 No.2775-2 - 2014/01/28 (火) 08:45:17 - tri TRIZOLの説明書では、脂質が多い組織ではChloroformを入れる前に遠心して脂質を除くように記載されてますね。 Chloroformを増やすと、DNAが水相にくる可能性があるようですが、1:1とかかなり多めな場合だそうです。 http://physiology.med.cornell.edu/faculty/mason/lab/zumbo/files/PHENOL-CHLOROFORM.pdf 実際、chloroformを増やすプロトコールもありましたし、あながち間違いではないと思うのですが、脂質を除く遠心はしたほうがよさそうですね。 http://macdougaldlab.physiology.med.umich.edu/Protocols/RNA%20Isolation%20from%20adipose%20tissue%20.htm

TRIzolを使っての脂質を多く含む組織からのRNA抽出 削除/引用 No.2775-1 - 2014/01/28 (火) 02:51:19 - fat reseracher "TRIzolを使っての脂質を多く含む組織からのRNA抽出"の正しいやり方を知っている方、教えて頂けないでしょうか? TRIZolを用いたマウスの各組織(心臓、肝臓など)からのRNAの抽出を、説明書のやり方に従って 1) 1mlのTRIZol中に組織50-100mgを入れてホモジェナイザーにかける 2) 0.2mlのクロロフォルムを入れて激しくチューブを振る 3) 遠心して、水層を別のチューブに移し、イソプロ沈〜70%エタノールでウォッシュ〜 というやり方でやっていました。 新しいラボに移って、脂肪組織からRNAの抽出を始めました。 脂肪組織では、上のやり方では 3)の遠心後の層の分離がうまくいきませんでした(透明な層にピンク層が挟まれた形になる)。 そこで、ブライダイアー法と一緒で分離がうまくいかない場合はクロロフォルムの量を増やせば良いだろうと、 2)で加えるクロロフォルムの量を0.4mlにしてみました。結果、分離がうまくいき、抽出したRNAは質的(260/280の比)にも量的にも問題なし、RT-PCRに使ってみた結果も問題なし、となりました。 よって、私は加えるクロロフォルムの量を増やすやり方にはなんの問題もないと思うのですが、同僚がケチをつけてきました。曰く、TRIzolとクロロフォルムの比を変えるなんてけしからん、そんなやり方で取ってきたRNAを使った結果なんて信用ならん、とのことです。 では、正しいやり方を教えて下さいといったところ、自分は知らないが、そんなやり方ではないはずだ、とのことでした。イチャモンに近いと思うので、真面目に取り合わなくても良いのかもしれませんが、もしかしたら自分が知らないだけで、他にきちんとしたやり方があるのかもしれないと思い、トピを作らせて頂きました。 クロロフォルムを多めに入れる以外の方法を知っておられる方、教えて頂けないでしょうか?よろしくお願いします。

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