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(無題) 削除/引用 No.2771-14 - 2014/01/31 (金) 05:41:07 - おお ご指摘のことは存じ上げてますけど、miRNAの関与を否定できるほどたくさんのmiRNAが翻訳抑制ではなく安定性に関与しているのでしょうか。。。50:50ぐらいであれば、関与を否定できないよね。

miRNA 削除/引用 No.2771-13 - 2014/01/30 (木) 17:57:58 - KIO miRNAは翻訳を阻害することが多いのですが siRNAのようにmRNAの分解を促進することもあります。 スレッドのテーマではありませんが Control of Cytokine mRNA Expression by RNA-binding Prteins and microRNAs, J. Dent. Res 2012, 91, 651-8 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22302144 などが参考文献です。

(無題) 削除/引用 No.2771-12 - 2014/01/30 (木) 17:29:49 - おお miRNa は翻訳制御によって発現を抑制したりすることも多いのでは?

自分もそう思ったのですが 削除/引用 No.2771-11 - 2014/01/30 (木) 17:03:23 - KIO mRNAのstabilityには影響はありませんでした。 ということはmiRNaの関与も否定的かな、と… まあ、可能性を一つ一つ実験的に検討します。

(無題) 削除/引用 No.2771-10 - 2014/01/30 (木) 12:31:35 - mon メチル化以外にも、mRNAの安定性が変わる、例えばmiRNAが誘導されるとかだと厄介？

(無題) 削除/引用 No.2771-9 - 2014/01/30 (木) 01:13:14 - おお どこまで万能かわかりませんがメチルか阻害剤もありますが、、、まあいきなりDNAのメチルかをみてもいいでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.2771-8 - 2014/01/30 (木) 01:10:31 - おお まあメチルかは調べてみてもいいかと思いますが、ほかの可能性を排除できるほどのデーターではないですね。それを念頭に入れながらみてみればどうでしょうか。すでにしてきしましたが、一過性に導入されたプラスみドも細胞内のメチレーションのシステムにかかることはあるようなので、ゲノム同様のことがおこっても不思議ではないですが、やはり染色体とはちがうので、完全にそう言う制御がかかるかというとかからなくても不思議ではないと、、、結論がでないながらにおもってます。

ありがとうございます、再び 削除/引用 No.2771-7 - 2014/01/29 (水) 17:46:34 - KIO ＞もう一度確認しますが、アッセイ系の「レポータープラスミドに組み込んだプロモーター」はゲノムDNAに組み込まれた状態という事ですね。 ・・・ゲノムＤＮＡに組み込まれていません、transient transfectionでレポーターアッセイを行っています・・・ 文献として報告された実験データまではなさそうですが推測する限り、レポータープラスミドに組み込まれたプロモーター領域はtransient transfectionという条件下でgenomic DNA上と同様なメチル化を受けるとは思えないですよね… ということは化合物の有無でgenomic DNA上のプロモーター領域のメチル化が影響を受けるかどうかは調べる価値がありそうですね。 ＞その化合物がメチルかを促進しているなら、あらかじめその化合物で処理しているわけだから、すでにメチル化されていて上昇すらしないというシナリオになりそうですが、、、 ・・・そうなんですよ、自分もそう思います・・・ 但し、今回の実験では化合物添加３０分後に細胞を刺激、そして細胞刺激２，６，１８時間後に当該遺伝子のmRNAを見ています。すると、２時間後：mRNA発現に差なし、６時間後：コントロールと比べmRNA発現量約６０％、１８時間後：コントロールでは６時間後よりmRNA発現量が上昇しているが、化合物が存在していると６時間後より低下している、ということなんです、詳しく書くと。 ですので化合物添加１８時間後に細胞刺激した場合は細胞刺激２時間後でもmRNA発現に差が出るかも…しかし、問題は 細胞刺激そのものによりgenomic DNA上のプロモーター領域のメチル化が低下し、その低下を化合物が妨げている可能性もあります。となると、やはり、 化合物添加３０分後細胞刺激、細胞刺激１８時間後にgenomic DNA上のプロモーター領域のメチル化を調べるべきとなりますよね。つまり、化合物添加-/+と細胞刺激-/+の組み合わせ４通りで比較するわけです。

(無題) 削除/引用 No.2771-6 - 2014/01/29 (水) 17:22:12 - おお http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11576873 余談ですが、プラスみドがメチル化されるという話はあるにはあるみたいですね。 レポーターをゲノムに組み込んだ状態でメチルかが起こるかといわれると、起こるべきもの(配列)がそろっていればおこるでしょう。その1kの部分だけでなく、あるいはその部分よりもほかの上流や下流の配列が必要なのかもしれません。 少なくともあなたの実験で抑制的に働くために必要なサイレンサーcisエレメントはその1k以外のところにありそうです(メチル化かどうかはおいておいて)

(無題) 削除/引用 No.2771-5 - 2014/01/29 (水) 17:01:21 - おお >[Re:3] KIOさんは書きました : > 特にmRNAの発現プロファイルを見ると、コントロールでは細胞刺激１８時間までmRNAの発現が上昇しているのが化合物を添加しておくと刺激６時間後以降、上昇から下降に転じていくのです。このプロファイルからプロモーターを活性化する転写因子にではなくプロモーターのepigenesisに影響を与えているのではないかと推測しているのです。 その化合物がメチルかを促進しているなら、あらかじめその化合物で処理しているわけだから、すでにメチル化されていて上昇すらしないというシナリオになりそうですが、、、 そうするとメチルかよりも何かほかの要因のような気がしました。

(無題) 削除/引用 No.2771-4 - 2014/01/29 (水) 17:01:11 - mon > レポータープラスミドに組み込んだプロモーターでもgenomic DNA上のプロモーター同様にメチル化されるか？ もう一度確認しますが、アッセイ系の「レポータープラスミドに組み込んだプロモーター」はゲノムDNAに組み込まれた状態という事ですね。 おそらく1kbだと短すぎる、あるいは安定組み込み状態になってからの時間が短いので、組み込まれた周りのゲノムDNAのメチル化に似たような状態に留まっているのではないかと思われます。 参考になるか不明ですが、CMV プロモーターなどウィルス由来のプロモーターは、ゲノムに組み込まれてから1~数ヶ月培養しているとメチル化され転写が抑制されます。 同じようなメチル化の状態にしたいと思うのでしたら、当該遺伝子領域にKnock-inする、もしくは10kb以上(可能ならば数個のイントロンを含む：どちらかというと核マトリクス結合領域が必要？？）のBACサイズに近いplasmidが必要ではないかと思います。 ざっくり言うと1kbだと短すぎてメチル化を起こすための目印がない（入らない）のではないでしょうか。 なお、transient transfectionしたプラスミドは、ゲノムDNAに組み込まれておらず環状DNAのまま存在します。また（核マトリクス結合領域が組み込んでないなら）ゲノムDNAのように核マトリクスなどの結合していないなどゲノムDNAとは異なる状態にあると言えます。ですからメチル化されなくても不思議ではありません。

ありがとうございます 削除/引用 No.2771-3 - 2014/01/29 (水) 15:49:10 - KIO コメント、ありがとうございます。確かに文献がなく困っています。 なお、今回の質問の要旨は transient transfectionしたプラスミドが細胞内でメチル化されるか？ ではなくて レポータープラスミドに組み込んだプロモーターでもgenomic DNA上のプロモーター同様にメチル化されるか？ です。というのも、ある化合物を添加すると特定の遺伝子のmRNA発現が抑制されるのですが、その遺伝子の既に特定されたプロモーター1 kbpを組み込んだレポーターで検討しても化合物によりプロモーター活性は影響を受けません。その一方、mRNAのstabilityも化合物による影響を受けません。 ということで化合物の作用の可能性として �@レポーターアッセイに組み込んだプロモーター領域以外に影響を与える。 �AプロモーターDNAのメチル化を促進する。 �Bヒストンの修飾に影響を与える。 などを考えている次第です。 特にmRNAの発現プロファイルを見ると、コントロールでは細胞刺激１８時間までmRNAの発現が上昇しているのが化合物を添加しておくと刺激６時間後以降、上昇から下降に転じていくのです。このプロファイルからプロモーターを活性化する転写因子にではなくプロモーターのepigenesisに影響を与えているのではないかと推測しているのです。

(無題) 削除/引用 No.2771-2 - 2014/01/29 (水) 13:44:55 - mon 一過性発現実験（数日）なら、新規のDNAメチル化は起きないと思います。 確証はありませんが、転写がほとんど抑制されないことからの推測です。 なお、大腸菌内でplasmidは固有のメチル化を受けていますので注意。 実験の都合上メチル化していないDNAを用意するには、PCR法またはRCA＋制限酵素処理を用いると良いでしょう。 ゲノムに組み込まれた状態だと、約1 kbp（Luciferase遺伝子いれても3kbほど）と短い領域ですから、周りのゲノム環境の影響を受ける可能性が高いと思われ、メチル化の予想は難しいと思います。 （論文を探していないので推測です。）

レポーターアッセイとDNAメチル化 削除/引用 No.2771-1 - 2014/01/27 (月) 13:19:20 - KIO Luciferase reporterにサイトカイン遺伝子のプロモーター約1 kbpを導入して実験しています。 このようなレポーター上のプロモーターでもgenomic DNA上の当該遺伝子プロモーターで生じるDNAメチル化が起きるものでしょうか？

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