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(無題) 削除/引用 No.2715-5 - 2014/01/10 (金) 11:36:02 - AA 既にご指摘のあるように、 PFA中ではRNase活性はほとんど考慮する必要はありません。 むしろRNase失活のために利用している感もあります。 RNA実験は多くの試薬を専用に用意しているところが多いかと思いますが、 PFAについてはどのラボもそうしていないのではないかと思います。 灌流固定は胎児の心臓経由でやります。 母胎から素早く摘出した後、実体顕微鏡下でやれば十分にできます。 E14くらいまでなら可能です。

(無題) 削除/引用 No.2715-4 - 2014/01/10 (金) 01:24:17 - おお PFAは蛋白変性を促しますし、その処理でRNaseが活性化すると思えませんが。ただPFAなどでの固定処理があまりにも長すぎると、RNAにたいしても化学的変化が蓄積するでしょうから、気をつけた方がいいかもしれません。 なのでどの様に迅速に固定作業に移るかだとおもいます。 ハイブリのバッファーなども蛋白をへんせいさせる成分がはいっていますから(組成にもよるかもしれませんが)、あまり神経質になりすぎない方がいいと思います。 とあまり経験がないながらにおもってます。

(無題) 削除/引用 No.2715-3 - 2014/01/10 (金) 00:39:03 - お正月ぼっち AA様> ご回答ありがとうございます。 胎生中期のマウスを用いる予定ですが、この場合の還流固定は母親マウスの還流固定を行うという認識でよろしいのでしょうか。 また、PFA固定等をO/Nで行うとRNaseのリスクが高くなるのではないかと思っていたのですが、気にしすぎだったでしょうか。もしくはPFA等の試薬はすべてRNA実験用として使用されているのでしょうか。 度重なるご質問となって大変申し訳ございません。

(無題) 削除/引用 No.2715-2 - 2014/01/08 (水) 17:15:10 - AA どのステージかにもよりますが、 胎生後期であれば、4%PFAで灌流固定をして、 後固定一晩、スクロース置換一晩、OCT包埋 という流れから薄切して染色までできます。 灌流固定しない場合でも、摘出後直接PFA一晩からでできますが、 血の抜け方が毎回かなり異なります。 ただ、ほとんどのISHのプロトコルでは はじめにPFAで固定してから始めますので、 それに従ってやれば問題なくできるのではないかと思います。

胎仔マウスのISH 削除/引用 No.2715-1 - 2014/01/08 (水) 16:27:14 - お正月ぼっち はじめまして。現在胎仔マウス脳(正面切片)でのIn situ hybridizationを検討しています。 そこでご質問なのですが、ISHを行う際は内因性RNaseの影響を気にしなくてはいけないという認識で、胎仔回収後の処理をどう行うのがいいのかいまいちはっきりしません。 これまで抗体染色する際は、胎仔摘出→PFA固定(O/N)→OCT包埋/切片作製→染色という流れで行っていましたが、ISHの場合はOCT包埋/切片作製の後にPFA固定を短時間行った方がよろしいのでしょうか。また、どの時点でサンプルを保存するのが一般的でしょうか。 初心者的な質問で申し訳ないですが、何かコツなどもあればご教授いただけると助かります。

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