BioTechnicalフォーラム [プラスミドの発現確認・WBバンドがおかしい？]

プラスミドの発現確認・WBバンドがおかしい？

No.2714-TOPIC - 2014/01/08 (水) 12:57:35 - プラスミダー

いつもお世話になっております。

現在、本研究室である遺伝子を研究する過程で、次のような事例が起きていて判断に困っています。

ある遺伝子：X

先日、ある遺伝子の蛍光融合タンパク質発現ベクター、pEFBOS-X-mCherry-Flagを作製しました。
この発現ベクターが正しくワークするか確認したく以下のようなサンプルをSDS-PAGE展開し、anti-Flag抗体、anti-X抗体でWBしました。WB時、おなじメンブレンを使用し、ストリッピングして2つの抗体を私用しました。

ノントランスフェクションCOS7ライゼート(ネガコン)
pEFBOS-X-mCherry-Flag導入COS7ライゼート(未知サンプル)
pEFBOS-X-HA導入COS7ライゼート(Xポジコン)
pEFBOS-mCherry-Flag導入COS7ライゼート(Flagポジコン)

その結果、
anti-X抗体WB
バンドなし【(ネガコン)】
予想位置含む複数個所にバンドあり【(未知サンプル)】
予想位置にバンドあり【(Xポジコン)】
バンドなし【(Flagポジコン)】

anti-Flag抗体WB
バンドなし【(ネガコン)】
予想位置含む複数個所にバンドあり【(未知サンプル)】
バンドなし【(Xポジコン)】
予想位置にバンドあり【(Flagポジコン)】

という感じでした。
問題は抗X抗体WBの未知サンプルのバンドで一番強いバンドが予想位置と異なること、抗Flag抗体WBの未知サンプルのバンドで一番強いバンドがやはり予想位置と異なり、二つの最強バンドがそれぞれ出ている位置が違うことです。

抗体が反応し、バンドが出ているということは発言はしていると思います。
このような結果になるということは、発現後に分解されているのでしょうか？
蛍光タンパク融合すると分解されやすいということはあるのでしょうか？(Xポジコン、Flagポジコンは分解されていないように見える。)
こういう場合はプラスミドを作り直したほうがいいのでしょうか？その場合はどのように作り直せばいいのでしょうか？

ちなみにシークエンスで配列を確認し、そこは問題ないと考えています。

どうぞお力をお貸しください。
　

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JCSBToCcxPOOcn

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No.2714-14 - 2018/02/17 (土) 17:49:28 - Barneyxcq

BV94ne http://www.LnAJ7K8QSpfMO2wQ8gO.com

(無題)

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No.2714-13 - 2014/01/14 (火) 13:32:39 - おお

りんかーさんありがとうございました。

(無題)

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No.2714-12 - 2014/01/13 (月) 16:13:37 - りんかー

>[Re:11] おおさんは書きました :
> りんかーさん
>
> 後学のためにおしえていただきたいと思うのですが、こういうケースでリンカーをいじって解決されたことがございますでしょうか?
> そのときはどの様にリンカーの配列を決めましたでしょうか?

これまで扱ってきたのが単純なタンパク質が多かったためか苦労したことがほとんどなかったので、リンカーの配列を検討した事はなく、一般論として挙げさせてもらいました。
ただ一度だけ、膜貫通（1回）タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現させようとしたときに、（おそらく）ゴルジ体に蓄積してしまってまったく発現できなかったことがあります。同じコンストラクトは他の論文ではよく使われていて、違いと言えばリンカーの配列だけでした。研究の流れとしてそれほど重要な部分ではなかったのでそれ以上検討しなかったのですが、リンカーの配列は重要なんだなと思った経験でした。
あまりお役に立てず申し訳ないです。

(無題)

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No.2714-11 - 2014/01/13 (月) 14:04:36 - おお

りんかーさん

後学のためにおしえていただきたいと思うのですが、こういうケースでリンカーをいじって解決されたことがございますでしょうか?

そのときはどの様にリンカーの配列を決めましたでしょうか?

(無題)

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No.2714-10 - 2014/01/13 (月) 12:51:50 - りんかー

> 蛍光タンパク質と同じ分子量のバンドがあり、そこに強いバンドがあったので、分解産物の蓄積が多そうです！
> 　被っているものとそうでないものがあります。Xは高分子量側に、Flagは低分子量側に強いバンドが出ている感じでした。

抗Flag抗体で見た場合に蛍光タンパク質単独とほぼ同じ分子量のバンドが見られたとすると、分解されていると考えるのが妥当ですが、抗X抗体では高分子側にバンドが見られるということはX-mCherryの融合タンパク質はフォールディングに失敗して凝集しているのかもしれません。
ただ、その分子量のバンドが抗Flag抗体で見られないのであれば別の可能性を考えないといけないですね。
3種類の遺伝子を用いているという事ですが、C末端側の構造は既知でしょうか。
C末端が疎水性でタンパク質内部に入るような場合ではC末端に融合するとフォールディングが上手くできない可能性が高くなります。HAやFlagのような短いペプチドならそれほど影響もでないでしょうが、mCherryなどではかなり大きいので構造が変化しても不思議ではないです。
その場合、リンカーの配列を伸ばすか、ドメイン構造と機能が既知であればタンパク質X内部にmCherryの配列を入れてしまうことも検討してみるとよいと思います。

> また、転写開始位置が間違ったようなバンドもありました。mCherryのメチオニンは抜いてあるので、mCherryは分解産物蓄積だと思いますが。コザックは先輩の言いつけでATGの直前に入れているのですが、変更するならどの位置にコザックを入れたらいいでしょうか？

コザック配列は開始コドンのAUGを含めた配列なので、位置を変更してはダメですよ。
配列を長くするとか、alternativeの配列を使うとかの意味だと思います。

(無題)

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No.2714-9 - 2014/01/12 (日) 18:57:09 - おお

蛍光タンパク質の安定性によって分解中間産物が比較的安定でドミナントになるようでしたら、リンカーの変更では改善しないように個人的にはおもいます。

実験によりけりですが、比較的細胞内に蓄積しにくい、半減期の短い蛍光タンパク質が開発されています。そう言う蛍光蛋白はリアルタイムの転写活性などを反映できるように工夫されたものなどです。

dEGFPでしらべてみてください。ほかにもあるかもしれません。

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No.2714-8 - 2014/01/11 (土) 23:07:47 - プラスミダー

＠Harmonia
光ってました！融合タンパク質も光ってました。

返信

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No.2714-7 - 2014/01/11 (土) 23:06:20 - プラスミダー

みなさんアドバイスありがとうございます！
補足：当研究室で解析している3遺伝子で前述のような問題が起きています。ので、遺伝子Xはその３つのいずれかで単一の特定遺伝子ではないです。

＠おおさん＆sendさん
なるほど！確かに蛍光タンパク質と同じ分子量のバンドがあり、そこに強いバンドがあったので、分解産物の蓄積が多そうです！この場合はTransfection発現時間を短くするかLinkerを変えたPlasmidを作った方がいいですかね？
また、転写開始位置が間違ったようなバンドもありました。mCherryのメチオニンは抜いてあるので、mCherryは分解産物蓄積だと思いますが。コザックは先輩の言いつけでATGの直前に入れているのですが、変更するならどの位置にコザックを入れたらいいでしょうか？

＠りんかーさん
1. 複数バンドって何種類か
　遺伝子によるのですが、多いものは5つバンドが出ています。

2. 抗X抗体と抗Flag抗体で強く出ているバンドの分子量を合わせると、融合タンパク質の分子量になるか
　二つの分子量を足すと予想される融合タンパクバンドよりもかなり大きい値になってしまいます。

3. それぞれの抗体で出る複数のバンドはかぶっているか
　被っているものとそうでないものがあります。Xは高分子量側に、Flagは低分子量側に強いバンドが出ている感じでした。

4. 抗体の反応する順番を変えても変わらないか（リプローブは上手くできているか）
　次回やってみます。
　

(無題)

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No.2714-6 - 2014/01/09 (木) 08:16:33 - Harmonia

mCherryはCOS7内で光ってましたか？

余談：
pEF-BOSは SV40 originをもっているらしいです。
http://www2.mfour.med.kyoto-u.ac.jp/~nagata/research/pef-bosex.html

(無題)

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No.2714-5 - 2014/01/08 (水) 16:15:53 - おお

可能性としては否定しませんが、それならX抗体でとランケーとと思われるバンドが出てくるのが説明できませんねぇ。。。

SDSPAGE上のサイズを過信するのはちょっとどうかと思う場合もありますが、mCherryのコンストラクトで全長と思えるものはありますか?また最長のバンドはマイナーバンドでしょうか?

N-terminalの開始こどん上流の配列を同一にそろえていたなら、ほかのこんストラクトからかんがえて、そこから翻訳されている蛋白がドミナントになってもという気がしますけど、、、それでもほかの短いものがドミナントになっているなら、分解産物の蓄積かなぁと思えるわけで、、、

転写

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No.2714-4 - 2014/01/08 (水) 15:50:25 - send

タンパク質Xの転写開始点には発現する予定の種に適切なコザック配列が付いていますか？
コザック配列が適切でないと発現効率も下がることもありますし、転写がXの内部の配列から起こり様々な長さの産物が生じやすくなってしまうこともあります。
mCherryの頭にメチオニンがあるのであればXを跳ばしてmCherryから転写しているものがあるかもしれません。
anti-Xとanti-FLAGでサイズのことなるものが検出されているようですが、anti-FLAGで検出されているバンドのほうが小さくありませんか？
上記のことを勘案するとmCherry-FLAGタンパクが主に発現誘導されている可能性があるかと思います。

(無題)

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No.2714-3 - 2014/01/08 (水) 14:52:13 - りんかー

もう少し情報が欲しいところです。

1. 複数バンドって何種類か
2. 抗X抗体と抗Flag抗体で強く出ているバンドの分子量を合わせると、融合タンパク質の分子量になるか
3. それぞれの抗体で出る複数のバンドはかぶっているか
4. 抗体の反応する順番を変えても変わらないか（リプローブは上手くできているか）

融合するリンカー配列にたまたまプロテアーゼの認識配列が入ってしまうと分解される事もあると思いますが、融合タンパク質が一般的に分解されやすいというわけではないと思います。
融合する事でフォールディングや輸送に支障をきたしたりすると、分解される事もあり得ます。
その場合は、リンカーの配列を伸ばすなりして対処することになると思います。

(無題)

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No.2714-2 - 2014/01/08 (水) 13:17:42 - おお

mCherry特定のはなしではないのですが、この手の蛍光蛋白は非常に安定していて、分解産物が蓄積している可能性はありますね。

プラスミドの発現確認・WBバンドがおかしい？

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No.2714-1 - 2014/01/08 (水) 12:57:35 - プラスミダー

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