BioTechnicalフォーラム [プラスミド内での相同組換え]

プラスミド内での相同組換え

No.2709-TOPIC - 2014/01/07 (火) 11:18:15 - pp

いつも勉強させていただいています。

15kb程度のプラスミドに3kb程度の挿入を行うためにλred recombinaseを用いた
相同組換えを考えています。
挿入したい場所に制限酵素サイトがなく通常のライゲーションによる
挿入はできません。相同組換えができれば１ステップで目的のプラスミドが
得られます。できなければ１からの構築なので煩雑になってしまいます。

BACではこの系は何度も経験があるのですが、BACに比べたら短い15kbという
プラスミドに対してうまくいくかどうか心配しています。

現在挿入する配列のクローニングをしているところですが、
もし経験のある方がいらっしゃいましたら、可能か難しいか、またはコツなど
ご意見をいただけないでしょうか。
　

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No.2709-5 - 2014/01/07 (火) 13:48:30 - pp

AP様

ご意見ありがとうございます。
現在インサートをクローニング中なので経験がある方がいればと思い
掲載しました。
15kb程度の短さだとBACに比べて分子の自由度が低くて入りにくいかななどと
根拠なく想像していました。

AP様　おお様

infusionのシステムは考えには上ったのですが、15kbを増やすとなると
どうしても欠失や置換、あるいはPCR自体が走るかなどと考えてしまい、
seqするのも大変だしと思い組換えを選択しました。

今回の場合、ある遺伝子についてすでに実績のあるターゲティングベクターの
exon1のfirstATGに外来のORF+pAを入れノックインマウスを作るためのベクターになります。
ターゲティングベクター側をPCRでふやすとなると、promoterやenhancer、neoカセット、Frtなど欠失や置換が起こっては困る（可能性がある）配列が
ほとんどなのでseqするとなるとかなりの距離を読まないといけないという
事情があります。

中年様

そうですね。私自身も大腸菌内でプラスミドがヘテロの状態になったと
思われる経験があります。そのときは、やはりプラスミドを抽出して
形質転換し直しました。
組換えさえうまくいけばそれらの問題は大丈夫かと思います。

(無題)

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No.2709-4 - 2014/01/07 (火) 13:01:38 - 中年

経験があるわけではないのですが、BACと違って普通のプラスミドはマルチコピーなので、相同組換えが起こったプラスミドと起こっていないプラスミドが大腸菌内で（少なくとも一時的には）共存することになるので、シングルコロニーアイソレーションを何度か行うか、回収したプラスミドでコンピテントセルを再度形質転換するなどする必要があるのではないでしょうか。

(無題)

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No.2709-3 - 2014/01/07 (火) 12:39:34 - おお

ベクター側を制限酵素tagつきinversePCRでふやして、ライげーしょんとかやることはあります。制限酵素認識サイトを作らなくとも、ブラントでライげーしょんもできますし。

(無題)

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No.2709-2 - 2014/01/07 (火) 12:09:25 - AP

BACでうまくいっているとのことですから、システムは持っているのですよね。
まず、やってみたらいいんじゃないですか。「BACに比べたら短い15kbという
プラスミド」であるということが理由で、うまくいかないという理屈は思い浮かばないですが。

別の方法として、Clontech (Takara)のIn-fusionシステムはいいんじゃないでしょうか(ベクター側はinverse PCRで調製）。

プラスミド内での相同組換え

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No.2709-1 - 2014/01/07 (火) 11:18:15 - pp

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