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(無題) 削除/引用 No.2708-7 - 2014/01/07 (火) 17:07:00 - よっしー セルソーターが使えるのであればできそうですが・・・

(無題) 削除/引用 No.2708-6 - 2014/01/07 (火) 16:59:38 - おお まてよ、、、表面にいるかもしれないなら、hypotonicで破砕して、静置か弱い遠心(600gぐらい)で核をおとすと、うわずみには細胞膜のフラクションがくるわけで、細胞などについてないものもそれぐらいならうわずみにきているだろうし。 ただ問題は、組織の細胞外のコラーゲンとかのでぶりは核とかと一緒におちてきそうな。 やっぱりポリとろんなどで破砕、DNaseしょり、ぱーこーるかなぁ。。。迷走しています。

(無題) 削除/引用 No.2708-5 - 2014/01/07 (火) 16:50:17 - おお >[Re:4] 通りすがりさんは書きました : > おおさん、 > いつも示唆に富むコメントありがとうございます。 > > パーコールは思いつきませんでした！ざっくりとヒト細胞とグラム陽性を分画するには2層でやればよいのでしょうか？　もしくは濾過膜のスピンカラムでもいけそうでしょうか？バクテリアのサイズは2x10マイクロメートル程度です。 えっ感覚だけで、それで実際やってそうだなあと思ったので、ヒントになればと思って書いたので具体的にはよくわかりませんが、、、 ぐぐるとこういうのも出てきますので、、、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3163351 細胞についている場合どうするかというのはありますが、、、あと菌種によってもデンシティーが変わってくるかもしれませんので調査が必要かもしれません。 ちなみに核はおるがねらを分離するときには40%パーコールで下に落ちてきます。 フィルターで分けるのは、詰まるかもと思ってかきませんでした。 > > ヒト細胞を溶解→ヒトDNAをDNase処理→病原体を遠心・回収→病原体DNA抽出 > →WGSという流れを想定しています。 > おおさんのコメント通りヒト細胞の核が溶けづらいことがネックですね。対象病原体の細胞壁は分厚くて頑丈なので弱い界面活性剤では溶菌されません（eg tween1%など）。この性質を利用しようと考えていたのですが、核は溶けてDNase処理も同時にできるようなアプリケーションに心当たりはないでしょうか？ クロマチンは塩濃度300mM (NaCl)より高いと緩んできます。それぐらいの塩でだいじょうぶであればDNaseでの分解はよういになるかもしれません。ただし、DNase自身がうまくそう言う塩濃度できくか確認が必要かと。だめならうすめてからということになりますが、容積がふえますね。。。完全に消化されなくても、そう言う状態になると、水中に分散されデンシティーがさがりますので、パーコールで比較的軽いそうにとどまりますので、バクテリアを効率よくとることができるかもしれません。この場合は単なる遠心でもいいかもしれませんけど、単なる遠心だとパーコールで除けそうな比較的軽い蛋白のデブリみたいなものも落ちてくるので、、、 まあ実際にやったことがあるプロとコールではないので、なにか条件が検討できるものがあればいいのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.2708-4 - 2014/01/07 (火) 16:14:39 - 通りすがり おおさん、 いつも示唆に富むコメントありがとうございます。 パーコールは思いつきませんでした！ざっくりとヒト細胞とグラム陽性を分画するには2層でやればよいのでしょうか？　もしくは濾過膜のスピンカラムでもいけそうでしょうか？バクテリアのサイズは2x10マイクロメートル程度です。 ヒト細胞を溶解→ヒトDNAをDNase処理→病原体を遠心・回収→病原体DNA抽出 →WGSという流れを想定しています。 おおさんのコメント通りヒト細胞の核が溶けづらいことがネックですね。対象病原体の細胞壁は分厚くて頑丈なので弱い界面活性剤では溶菌されません（eg tween1%など）。この性質を利用しようと考えていたのですが、核は溶けてDNase処理も同時にできるようなアプリケーションに心当たりはないでしょうか？ 最終目標はヒト検体からの病原体DNA精製系の確立とその普及ですので、なるべくシンプルで簡便にすることを目指しています。 引き続き、アイデアありましたらよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2708-3 - 2014/01/07 (火) 13:21:01 - おお 細胞を溶解するのはまあいいけど、核とかそう簡単に溶解されないから、細胞ではないけど粒子というかそう言うものは残ると思うけど、、、回収して何がしたいかにもよるかもとおもうのですが、

(無題) 削除/引用 No.2708-2 - 2014/01/07 (火) 10:25:19 - おお パーコールなどでデンシティーによる分離

ヒト細胞の選択的溶解法 削除/引用 No.2708-1 - 2014/01/07 (火) 09:14:57 - 通りすがり ヒト検体から病原体を濃縮して病原体の全ゲノム解析をおこなうことを計画しています。検体には不純物として粘膜細胞、マクロファージ等多数の宿主細胞が混入しており､数千分の１程度の存在割合で対象病原体（グラム陽性菌）が存在しています。 ヒト細胞を選択的に効率よく溶解して対象病原体を回収したいのですが、どのようなアイデアがあり得るでしょうか？ なお、病原体を分離培養するのが確実ですが、培養のバイアスがかかるので今回は検討していません。

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