BioTechnicalフォーラム [TRIZOLでの少数細胞RNA抽出]

TRIZOLでの少数細胞RNA抽出

No.2702-TOPIC - 2014/01/04 (土) 21:02:36 - 音

いつも参考にさせていただいております。

現在、凍結切片からLaser capture microdissectionでTRIZOLに回収した神経細胞(~500cells)のRNAを抽出しようと考えております。

回収方法としては
TRIZOL(50µl)に細胞を回収したtubeにTRIZOL加えて500µlにメスアップ
↓
クロロホルムを加えて遠心
↓
水相200µlを回収し等量の70%EtOHを加えてpipetting (余裕を持って水相の2/3ほど回収)
↓
RNeasy micro kit付属のカラムに加えて後はkitのマニュアル通りにRNA抽出
という方法で行っています。

※元々kitに付属のRLT bufferで回収していたのですが、RINが6~7前後であまり安定した結果がでなかったため回収bufferを変更してTRIZOLで回収しております。

TRIZOLで回収した細胞のRINは8前後で割と安定？しているのですが、収量がRLT bufferで回収したときと比べ大幅に少ない印象を受けます。(1/5以下でひどいときは1/10程度の時もあり)

抽出したRNAはマイクロアレイへの使用を考えており、ある程度の収量が必要なこともあり困っております。またRINもできる限り10に近づけたいという気持ちもあり、回収方法の検討が必要であると感じております。

そこでお尋ねしたいのですが、みなさんは少数細胞からRNAを抽出する際、収量やRINをあげるためにどのような方法で行っておりますでしょうか。アドバイスを頂けたら幸いです。

よろしくお願いします。
　

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No.2702-6 - 2014/01/08 (水) 08:45:24 - 通りすがり

phase lockを使うとtrizolの上清分取が簡単になりそうですね。私はフェノクロのときしか使ったことがありませんが。

(無題)

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No.2702-5 - 2014/01/07 (火) 00:49:04 - protein

私達の研究所ではIlluminaのArrayPureというRNA抽出キットの使用が
少量の細胞からのマイクロアレイに推奨されていました。
エタ沈のステップでのロスが心配だったのでプロトコルを改変して、
キャリアーを使ってエタ沈をしていました。
http://www.epibio.com/applications/nucleic-acid-purification-extraction-kits/rna-purification/arraypure-nano-scale-rna-purification-kit?details

また、お尋ねの件への答えにはならないのですが、
おそらく500細胞であれば2nd roundのamplificationということになると思われます。
この場合RNAの必要量はかなり少なくなるはずですので、
個人的には収量よりもRINにプライオリティをおいたほうがいいのではと思います。
この２つはなかなか両立が難しいのではないでしょうか。

(無題)

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No.2702-4 - 2014/01/05 (日) 06:42:35 - おお

>[Re:1] 音さんは書きました :

可能性として考えれることを書きます。

> 回収方法としては
> TRIZOL(50µl)に細胞を回収したtubeにTRIZOL加えて500µlにメスアップ

TRIZOLは細胞を溶解するときにちゃんと分散させないと収量が落ちるような印象があります。もっと多くの細胞を扱うときはニードルなどをつかってほぐすような方法もあります。
たとえばチップでヨクピペッティングするとかするといくらか収量があがるかもしれません。
> ↓
> クロロホルムを加えて遠心
> ↓
> 水相200µlを回収し等量の70%EtOHを加えてpipetting (余裕を持って水相の2/3ほど回収)

次にカラム精製のステップに入るのですから、水そうを全部回収しても言いように思いますがいかがでしょうか。あとエタノールなどアルコールの量が少ないとRNAが通過してしまう可能性があります。量的に微量なのでRNAの凝集に時間がかかるのかもしれません。アルコールを多めにしてしばらく静置するのも手かもしれません。あとはRNAがチューブに着いてる可能性かなぁ。。。びりょうなので、、、シリコン加工チューブだとどうかなぁと少し思ったりしますが。

(無題)

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No.2702-3 - 2014/01/04 (土) 23:47:54 - 直輝

あ、エタ沈はしてませんでしたね。

とりあえず抽出工程をシンプル化した方が収量は上がると思うんですが、qPCRならともかく、アレイの場合は良い知恵がないので、何か案が出てくれば参考にさせていただこうと思います。

(無題)

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No.2702-2 - 2014/01/04 (土) 23:37:01 - 直輝

500細胞は結構大変だなという印象です。

RNA収量が激減するのはチューブやチップへの吸着が主な原因です。
細胞数が多いときには吸着の影響を無視できますが（吸着する割合は微々たるものなので）、数千細胞のレベルだと吸着で失われるRNAの方が多いくらいです。それと、RNAの量が少ないのとエタ沈効率も悪くなるので、インキュベートや遠心時間を長めにした方が良いかもしれません。

マイクロアレイということでRNA増幅をされるつもりだと思いますが、どうしても500細胞しか用意できないのであれば、RINに多少目をつぶっても増幅に最低必要な量を確保するしかない気がします。
あまりアドバイスになってなくてすみません。

蛇足ですが、発現プロファイルの比較をされるのでしたら、増幅サンプルどうしで比較するようにして下さいね。（増幅サンプルと非増幅サンプルは比較できません）

TRIZOLでの少数細胞RNA抽出

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No.2702-1 - 2014/01/04 (土) 21:02:36 - 音

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