全29件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.2701-30 - 2014/01/07 (火) 15:27:08 - AP 経験則ことは別にどうでもよくて、わたしが問題にしているのは、 DNA量を増やすことで、何が改善されたり有利になるのだろうか、あるいは、 DNA量を増やさなければならないのは、どういう理由からか？ という論理的説明だったんです。つまりは、DNAを増やすということの本質的意義です。 ロジックとして、サイズが大きくなると形質転換効率が一桁落ちるから、という説明を波平さん自身がしていたわけです。それだけの理由で取れるべきものが取れなくなるほどの数字ではないということ、もし取れなくなるようなら何かが質的に低下しているところを量でカバーしているだけじゃないかと指摘したところ、、、、説明されればされるほど、このひと結局何が言いたいんだろう？　となってしまったんですけど。

(無題) 削除/引用 No.2701-29 - 2014/01/07 (火) 15:04:19 - 波平 APさん >つまり「効率の悪さを量を増やすという力技で乗り切る」っていうことだろうと。 本質は，「形質転換の影響を与える因子は複数あります。他の人に最近の形質転換の効率について質問してみてください。それで最も可能性が高いものを考えてください。少ない情報の中で私がアドバイスできるものとしては，その因子の１つにDNA量があります。使用しているプラスミドは大きいので，導入効率が通常のものよりも下がります。また，通常用いるベクターと同じ量を用いても数が違うため，同じような形質転換体数は得られません。このアドバイスは的外れかもしれません。しかし，自分で考えて判断して下さい」 何か間違った方向にいってそうなので，しばらくお邪魔します。

(無題) 削除/引用 No.2701-28 - 2014/01/07 (火) 15:03:28 - AP >"セルフライゲーションが起こるような条件"とは，制限消化が1種類で脱リン酸化していないベクターのことをいっており，量のことは述べておりません いちいち反応するのもいい年をした人間がすることではないが、検出可能な量(例えばng以上）のベクターでligationやっていてそれなりの量のDNAでトランスフォーメーションをしているはずで、たいていの制限酵素のligation/recutting効率は90%を越えるのであるから、形質転換体がでないという状況は考えにくいの。それともfgとかagとかでやった場合か？ >本来ならインサートが挿入されなくてもセルフライゲーションが起こり形質転換体が得られてもよいはずなのに，形質転換体が得られない場合は，用いるベクターの量が少ない場合が多いということです。 「場合が多いということ」だけを根拠に、量が少ないことが問題の本質であると考えるわけだ。そこに、手技や系など質的な問題は関係していないと考えるのか。 ベクターのクローニングサイトの単消化と二重消化をアガロース電気泳動で区別はできません。消化されたもの（linear）と未消化ccc (あるいは、OC)を分離するための切り出しです。二重消化ベクターを調製するとき単消化の残留が気になるときは脱リン酸化します。

(無題) 削除/引用 No.2701-27 - 2014/01/07 (火) 14:53:01 - おお >[Re:25] 波平さんは書きました : > "セルフライゲーションが起こるような条件"とは，制限消化が1種類で脱リン酸化していないベクターのことをいっており，量のことは述べておりません。 > 言いたいことは，本来ならインサートが挿入されなくてもセルフライゲーションが起こり形質転換体が得られてもよいはずなのに，形質転換体が得られない場合は，用いるベクターの量が少ない場合が多いということです。 そう言う場合が多いかどうかよくわかりませんが、具体的にどれくらいの量かわからないと議論にならないとおもいます。確かにセルフで100個しかコロニーが拾えなかったら何かが悪いとおもいますが、量なのか質なのかどちらが悪いでしょうときかれても、絶対量がわからなければ判断できませんよね。標準プロとコールでは万単位でセルフだと拾えるでしょうね。ベクターが大きくなってもまあ遜色内ほど拾えると思います。質が悪いと大きいベクターではいろいろと不利なこともありますので、この辺は絶対量を確認した上で判断した方がいいのではとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.2701-26 - 2014/01/07 (火) 14:45:05 - AP ああ、最初に酵素やコンピが悪いとか、手技が悪いとかいう可能性も並列的に書いておられるわけだ。 それらが良くても、量が少ないがために形質転換体が得られない場合があり、その可能性が第一と考えているわけだ、

(無題) 削除/引用 No.2701-25 - 2014/01/07 (火) 14:40:05 - 波平 APさん 私の書き方が悪いのかもしれませんが，文章ではうまく伝わりませんね。 >セルフライゲーションが起こるような条件で の "セルフライゲーションが起こるような条件"とは，制限消化が1種類で脱リン酸化していないベクターのことをいっており，量のことは述べておりません。 言いたいことは，本来ならインサートが挿入されなくてもセルフライゲーションが起こり形質転換体が得られてもよいはずなのに，形質転換体が得られない場合は，用いるベクターの量が少ない場合が多いということです。 これはゲル抽出するときのバンドの大きさ ところで，アガロースゲルでこれぐらいの長さの未切断，1酵素消化断片，2酵素消化断片て分けられるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2701-24 - 2014/01/07 (火) 14:36:42 - AP 波平さん まあ、落ち着いてください。わたしは、経験則というだけでなく、あなたの意見の本質どこにあるか、どういう生物学的、科学的説明をするとすれば、こういうことじゃないかということを指摘したまでです。 つまり「効率の悪さを量を増やすという力技で乗り切る」っていうことだろうと。 あなた、自分が何を言いたいのか突き詰めて考えてますか。 頭に血が上って、表面的に私の言葉尻をとらえて否定しようとするものだから、支離滅裂になっていますよ。 量の問題だ ↓ 量ではなくて数なんだ（本質的には同じ。問題のベクター話なのだから、量を増やせば分子数は増える） 3-4 kbベクター約2-3%の形質転換効率です。 ↓ 形質転換に及ぼす影響には下以外にも様々な要因があり，単純に2ケタおちで物事は語れません 2ケタ落ちは"最高値"に近い値と推察します。 いやいや、それ以上、下がるということは、だからそこに質的な問題が絡んでいると言っているではないですか。oriや薬剤耐性が違うから、ということをおっしゃっていますが、それ以外（手技の問題）という可能性は端らか論外ですか？ ちなみに、カナマイシン選択だからとか、oriが違いうからという理由で形質転換効率が桁違いに下がるものではないと思いますし、質問者さんもそんなに特殊なベクターを想定していないと思いますが（カナマイシンはアンピシリンと違って適正量の幅が小さいとは感じますが）。

(無題) 削除/引用 No.2701-22 - 2014/01/07 (火) 13:48:14 - 波平 >通常期待できるような十分な効率が達成されているとは言えないし、なにか質的問題で効率が数桁下がっているということでしょう。 下にも書いているとおり，形質転換に及ぼす影響には下以外にも様々な要因があり，単純に2ケタおちで物事は語れません。2ケタ落ちは"最高値"に近い値と推察します。 実験室で同じ複製起点をもつ3-4 kbのベクターを用いて同じようにライゲーションし形質転換し，カナマイシンで選抜した場合，どの位の形質転換体が得られているかお分かりでしょうか。分かれば，今回の形質転換では最高値でどの程度得られるか推察できます。 つまり， 1 ml LBを添加してポストカルチャーしたのち，100 µlプレートに塗布して, 100個の形質転換体が得られるのならば，"最高値"は2-3個となります。

(無題) 削除/引用 No.2701-21 - 2014/01/07 (火) 13:47:38 - おお あ、いちおう申し上げておきますが波平さんがcompetencyの悪いのをカバーしているというつもりはなかったので、、、一般論としてそう言うことがありましたということで。

(無題) 削除/引用 No.2701-20 - 2014/01/07 (火) 13:40:47 - おお >[Re:17] 波平さんは書きました : > おおさん > > >competencyの悪さを量でカバーしているような人も見受けられますね。それでもって簡単にできそうなコンスとらくとで、96wellプレート分拾って、コロニーPCRして一桁ポジとかやっているひとが、、、時間と労力との無駄ただかそんな方法押しつけないでくださいとおもったことがある。。。 > > 私も，あれを試して，これを試してと言われていろいろと試した挙げくうまくいかず，そんな無駄な方法をおしつけないでと思ったことが。しかし，これは押しつけた方が悪いのではなく，自分が考えて行っていないのが悪いのです。 いや考えて無駄と判断したので私はやりませんでした。明らかにコンピテンシーがわるいのでだめだと判断したのでそこからやりなおしました。経験上そこが悪いと、その様な結果になることがわかってましたので。 あとAPさんもおっしゃってますが、3kb程度のベクターであれば、ライゲーション後1000以上のコロニーが期待できる場合が多いので、わたしも取り立てて多く入れる必要はあまり感じません。ただしまあいろいろと難しくなる面もあるので、分子数であわせて量を調整するのは否定いたしません。

(無題) 削除/引用 No.2701-19 - 2014/01/07 (火) 13:31:20 - AP で、とくに気になったのが、 >セルフライゲーションが起こるような条件で形質転換して形質転換体が得られない場合は，だいたい1の理由です。 という記述で、いくらサイズが大きくて形質転換効率の桁が下がったとしても、常識的なDNA量(数 ngだろうが数十 ngだろうが）のセルフライゲーションで形質転換体が得られないって、どれだけ効率が低いんだろうと。量を増やせば形質転換体は得られるかもしれないし、それで目標は達するかもしれないけれど、根本的なところで質的な問題があるんだろうなと、

(無題) 削除/引用 No.2701-18 - 2014/01/07 (火) 13:15:56 - AP >3-4 kbベクター約2-3%の形質転換効率です。 つまりせいぜい二桁しか低下しないということでしょう。 ベクターサイズが大きいがために、二桁落ちて形質転換体が０になるということは3-4 kbベクターの場合でも数10 ng使っても、二桁以下の形質転換体しか生じないということでっしゃろ。 そら、通常期待できるような十分な効率が達成されているとは言えないし、なにか質的問題で効率が数桁下がっているということでしょう。 品質の悪さ、効率の低さを量を増やすことで乗り越えるという考え方を否定するものではありませんが。

(無題) 削除/引用 No.2701-17 - 2014/01/07 (火) 13:15:07 - 波平 おおさん >competencyの悪さを量でカバーしているような人も見受けられますね。それでもって簡単にできそうなコンスとらくとで、96wellプレート分拾って、コロニーPCRして一桁ポジとかやっているひとが、、、時間と労力との無駄ただかそんな方法押しつけないでくださいとおもったことがある。。。 私も，あれを試して，これを試してと言われていろいろと試した挙げくうまくいかず，そんな無駄な方法をおしつけないでと思ったことが。しかし，これは押しつけた方が悪いのではなく，自分が考えて行っていないのが悪いのです。また，それが無駄なのかどうかは結果論に帰する場合もあり，判断が難しことも少なくないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2701-16 - 2014/01/07 (火) 12:42:22 - 波平 APさん >DNA量が少ないといっても、検出可能なレベルの量を使っているはずだし（ng以上）、お書きになっているような例では、少なくとも2-3桁の形質転換体は得られていいはずですが。 大切なのは量ではなく，数なのです。 だいたいのクローニングベクターは3-4 kbであり，1回の形質転換に50 ng用いられています。仮に，今回も50 ng用いているとすると,数は約1/5-1/4になります。 さらに下にも書いていますが，長さが18 kbになると形質転換効率は10%程度になります。形質転換効率がこのDNAの個数レベルでは個数に比例すると仮定すると（実際はどうか不明です），単純にこれだけで，形質転換効率は1/40程度になります。つまり，3-4 kbベクター約2-3%の形質転換効率です。 これにはさらに，選択がアンピシリンかカナマイシンかでも効率は変わってきます（経験上，アンピシリンの方が形質転換体は得やすい）。 また，複製起点が何かによっても変わってきます。 詳細が分からないので，以上を踏まえて私なりにアドバイスするとなると，ライゲーション濃度もしくは量を増やしてライゲーションして，エレポでしてみればと，さらには大きいプラスミドを入れる用の大腸菌もあるよ。

(無題) 削除/引用 No.2701-15 - 2014/01/07 (火) 12:34:37 - おお 例えば3kbのベクターだと標準的なプロとコールだと20とか50ngとかライゲーションに持ち込むんでしょうけど、それが15kbになると同じ分子数なら100から250ngとなるので、そう言う意味では量は多めに使うことになるかもしれません。 あと私もゲル精製派です。しなくてもごまかせる場合は難易度が高くない限りごまかしますが。

(無題) 削除/引用 No.2701-14 - 2014/01/07 (火) 12:28:09 - おお >[Re:13] APさんは書きました : > >１．DNA量が少ない（特にベクター側＝複製起点をもつ方のDNA断片） > >セルフライゲーションが起こるような条件で形質転換して形質転換体が得られない場合は，だいたい1の理由です。 > > それはDNAの品質の悪さを量でカバーしているということではないでしょうか。 competencyの悪さを量でカバーしているような人も見受けられますね。それでもって簡単にできそうなコンスとらくとで、96wellプレート分拾って、コロニーPCRして一桁ポジとかやっているひとが、、、時間と労力との無駄ただかそんな方法押しつけないでくださいとおもったことがある。。。

(無題) 削除/引用 No.2701-13 - 2014/01/07 (火) 11:55:26 - AP >１．DNA量が少ない（特にベクター側＝複製起点をもつ方のDNA断片） >セルフライゲーションが起こるような条件で形質転換して形質転換体が得られない場合は，だいたい1の理由です。 それはDNAの品質の悪さを量でカバーしているということではないでしょうか。 DNA量が少ないといっても、検出可能なレベルの量を使っているはずだし（ng以上）、サイズが大きくて、あるいは宿主細胞の品質が劣るために形質転換効率が低2-3ケタ低いとしても、お書きになっているような例では、少なくとも2-3桁の形質転換体は得られていいはずですが。

(無題) 削除/引用 No.2701-12 - 2014/01/07 (火) 11:45:40 - AP 私は切り出しは出来る限りやるのがいいと思っています。 切れ残りの環状DNAを取り除くにはそれしかないからです。 アルカリ処理を経て精製されたプラスミド（ccc）には、多かれ少なかれ部分的に解離したものが混入します。環状に閉じていて超らせんとなっているDNAでは、線形やニックの入ったDNAと違って、DNA鎖の自由回転で歪みを解消することは出来ないので、解離が部分的であってもDNA全体に歪みを生じます。そうなると、いかなる制限酵素も効きません。一部を電気泳動で見えないレベルであったとしても、これが少量でも混じっていると（じっさいそうであることがほとんどですが）、それが宿主を形質転換して非組換え体のコロニーを生じます。たとえば、検出限界より3ケタは低い1 pg混じっているだけでも数百は出てくる可能性があるわけです。難度の低いクローニングでは、非組換え体がそこそこ生じても、組換え体の割合が高いので実際上の問題にはなりにくいですが、難度が高く組換え体が得られにくい場合は、こうして生じた非組換え体ばかりになって非常に艱難な状況になります。 もし、二重消化のベクターでリンカー部分の混入とそれがライゲーションで再挿入することを心配するだけなら、脱リン酸処理するだけで良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2701-11 - 2014/01/07 (火) 11:40:15 - 波平 形質転換体が得られない場合は以下のことが考えられます。 １．DNA量が少ない（特にベクター側＝複製起点をもつ方のDNA断片） ２．リガーゼが上手く働いていない。弱っている。 ３．コンピの形質転換効率が低い ４．手技が悪い（試薬の調製ミスなどを含む） ４は正しくされているとの前提ですが， 2と3は同じ物を他の人が用いていて違和感がなかったり，自分が他の実験で用いた時に違和感がなければこだわらなくてもいいのでは。 なので結局は１に帰するような気がします。 セルフライゲーションが起こるような条件で形質転換して形質転換体が得られない場合は，だいたい1の理由です。 今回のような場合では，ライゲーションに用いる時のDNA濃度を増やすなり，DNA量を増やしてエタ沈して一回の形質転換に用いるDNA量を増やすなり，エレポするなりして，とにかく形質転換体を得ることが重要です。そうしなければ実験を進められません。 あとはコロニーPCRなどで目的のものを選抜できる可能性があるのですから。

(無題) 削除/引用 No.2701-10 - 2014/01/07 (火) 05:14:23 - おお 敵意はないのですが私の感覚と違うのでその点を書き加えます。でほかの皆さんがどうおもわれるか。 >[Re:9] どんとこいさんは書きました : > １　DNAのゲル抽出は、効率がとても悪いのでなるべく使わない 抽出効率だけを考えると10%であっても1ugあれば100ng取れますので個人的にはあまりきにならないです。ゲルの濃度を0.6%とか下げると効率はあがるとおもいます。後はキットが大きすぎると対応しきれていない可能性はありますが、、、 > ２　プラスミドサイズも10 kbを超えるとケミカルコンピテントセルの効率が極端に下がる 感覚的に極端に落ちてくるのは20-25kbpあたりだと思っていますが、、、ただインサートなどが大腸菌からとった抽出したDNAでなく、長いなら不利になるとはおもいますが。 > ４　それより両者のDNA濃度を上げる努力が大切 濃度をあげすぎて、大腸菌に複数のプラスみどが入った場合目的のものが極端に長いのにたいしてライゲーションされてないものなどが短い場合大腸菌内でつなげられなければならないという不利な点があっても、大腸菌内で短い方が有利。過剰のDNAはコロニーを見かけ上増やすけど難しいクローンを拾うのに不利になることがおおいです。またライブラリーを作るなら、なるだけ計算上一つの大腸菌に一つ以上のプラスみドが入らないように濃度をせっていしますよね。 また特に長い物を扱うとき、両方の末端の自由度が上がりますから、1分子(あるいは目的のインサート、とプラスみド一分子づつ)内でのライゲーションとタンデムにつながってしまうライゲーションの確率に差がなくなってくる。そうすると、ライゲーション時には濃度が低い方がいい。またそう言う条件でライケーションが成立するには時間がかかるので、O/Nとかすこし時間をかけたほうがいいとおもう。 > ５　10 kb超えるとDNAは溶けにくくなるので，エタ沈など極力しない きれいに精製したゲノムなどでも、そんなに苦労することがなく解かせますけど、、、20kb近くのものを扱っていて解かすのに苦労したことがありません。。。 > ６　ligationはよっぽどのことがないかぎり、うまくいっている、安心してよい 最近のキットは安定しているのかもしれませんが、過信するのはどうかとおもいますが、共同でつかっていてだれかざつなあつかいしてたとか、まあそうでなくても、保存、冷蔵庫、冷凍庫のコンディションはそれぞれのラボで違いますし、さいあく不良のロットや代理店での保存その他で不適切なことがあったとか、、、ポジこんをとればいいだけなので、全くスルーすると落とし穴があるかもと。 > ７　ベクター側（Amp）とインサートのベクター（Kanamycin）を異なるものにすべき それは楽に扱える一つのtipだとおもいますが、そうでなくてもこなしている人はおおいとおもいます。 > ８　プラスミド切断後，可能ならインサートのマルチクローニングサイトにあるユニークサイトを切断し、ごく短い断片（50 bp 以下）を切り出し、Amicon ultra 100K などのフィルターで３回filtrationしてその短い断片を除くとよい > ９　同様にベクター側も、もしlinkerのようなごく短いものが切り出されてくるようなら、Amicon ultra 100K などでのぞくとよい この手の工夫はいろいろありますね。短いフラグメントならプラスみドクリーニングキット(ミニプレっぷのカラムとおなじもの)とかでものぞけないかなぁと思ったりもします。核酸用のゲル濾過スピンカラムもうられてますね。

全29件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---