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(無題) 削除/引用 No.2692-4 - 2013/12/28 (土) 03:28:33 - protein マイクロアレイであれば数百細胞あれば現在のamplificationの技術なら十分と思います。 なので、私だったら難しく考えずFACS sortingします。 Pre-Enrichmentに関しては若干のロスはあるかと思いますが、 上記の理由により、多少のロスは気にしないでsortの時間短縮を取ります。 あくまで私ならということですが参考になれば幸いです。

アレイの標識方法とRNAグレード 削除/引用 No.2692-3 - 2013/12/26 (木) 15:36:10 - ema アレイはDNAでしょうか、RNAでしょうか、μRNAでしょうか。たぶんRNAと仮定して 　表面抗原で染色できセルソーターで生きたまま細胞を分けることができるならそちらのほうが好ましいと思います。（ソート時間が長いし大変だとは思いますが） MACS等でソート前のエンリッチはソート時間の短縮とか便利なのですが、作業ステップが増えるとロスが多くなり最終的に得られる細胞数が減ると思います。 ダイセクションは（組織固定→組織切片；ないかも）はがれないようにスライドへの固定・染色（染色も核染色で単色の短い時間ならともかく、抗体染色で2次抗体までかけると水系；RNAaseが働き易いです；作業時間が長くなる）等でRNAの分解が進み、RT-PCRならともかく既存のアレイにはお勧めしません。 ＊分解したRNAで検出試薬もあります。が、通常の試薬で標識した結果とすこし異なるので、比較解析は気をつけないといけないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2692-2 - 2013/12/26 (木) 14:06:52 - おお >[Re:1] クリスマスぼっちさんは書きました : > いつも参考にさせていただいております。 > > 現在、マウス胎仔組織で発現するとある細胞集団の濃縮を検討しております。ある程度のタンパク発現であれば、セルソーターなどで濃縮できるのですが、実際の細胞は胎仔１個体で数百細胞あるかどうかといった具合です。 ある程度の蛋白発現とおっしゃってますが、そのターゲットの細胞には強く発現していないのですか? 一固体で数百、マウスでは十数匹の胎児を生みますよね。。。数は稼げそうですが、、、。マウスでなくて、ラットにすればもう少しやりやすいかもしれません。セルソーターにかける前に、だいセクション、その他でえんりっちする手はあります。細胞表面にあるマーカーがわかっていればそれに対する抗体などでエンリッチできますし、発現していない蛋白の抗体でネガティブセレクションというてもありますし、抗体がだめなら、細胞の接着性の違いを利用するとか。 > > そこでお尋ねしたいのですが、このような場合、みなさんならどういったアプローチで表記実験を行いますでしょうか。 表記実験ってなんでしょうか。。。 >組織染色で目的細胞集団の標識は行えるのでマイクロダイセクションも考えているのですが、この方法が妥当かどうか決めあぐねている段階です。 > 細胞濃縮後の解析ではマイクロアレイを考えております。 > ぜひご助言・アドバイスお待ちしております。 実験目的そのたよくわかりませんので具体的なことは申し上げられませんが、方法論は何が取れるか、取れないかを考えて、取れる方法でやるということになるのかと思います。そして同時に取れる方法論から欠点をしっかり分析して、どう補うのかなど考えるようにした方が生産的と思いますがどうでしょうか。

少数細胞の濃縮方法 削除/引用 No.2692-1 - 2013/12/26 (木) 13:41:29 - クリスマスぼっち いつも参考にさせていただいております。 現在、マウス胎仔組織で発現するとある細胞集団の濃縮を検討しております。ある程度のタンパク発現であれば、セルソーターなどで濃縮できるのですが、実際の細胞は胎仔１個体で数百細胞あるかどうかといった具合です。 そこでお尋ねしたいのですが、このような場合、みなさんならどういったアプローチで表記実験を行いますでしょうか。組織染色で目的細胞集団の標識は行えるのでマイクロダイセクションも考えているのですが、この方法が妥当かどうか決めあぐねている段階です。 細胞濃縮後の解析ではマイクロアレイを考えております。 ぜひご助言・アドバイスお待ちしております。

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