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(無題) 削除/引用 No.268-15 - 2012/03/12 (月) 11:33:41 - あい ありがとうございます。Magic Markですね、機会があれば使ってみたいと思います。Magic Markが検出できていると言うことは、二次抗体は活きているものを使っていると言うことでしょうか。一次抗体、二次抗体の組み合わせが間違っていなければ、一次抗体のステップに何かある可能性が高いってことかなぁ？？？

(無題) 削除/引用 No.268-14 - 2012/03/12 (月) 10:58:07 - ｂｎ 皆様回答ありがとうございます。 皆様の意見で、やはりどこかで単純ミスをしている可能性が高いということがわかりました。 ~ 様＞ 説明不足ですみません。 非特異バンドは先生と同じように出ていますが、私は目的バンドのみほとんど検出できず、泳動レーン以外にまだら模様等は見られないという状態です。 目的バンドは非特異バンド以下の薄さで、僅かにはあるように見えます。 2次抗体のみを反応させた場合は非特異バンドは検出されませんでしたので、1次抗体による非特異バンドだと考えています。 直輝様＞ 1度失敗した後から、液量は先生より多く使用しています。 ただし、ハイブリバックでの抗体反応は始めて２ヶ月位ですので、その辺に問題があるのかもしれません。 あい様＞ 写真を見ていただくのが一番早いので、見ていただきたいとは思うのですが、問題になると取り返しがつかないので申し訳ありませんが公開はしないでおこうと思います。 マーカーは、旧invitrogenのMagic Markです。試薬類は写真現像で使うものと変わりありません。 反リア充様＞ 一度失敗した後、主な試薬類は実物を先生と確認して同じ物を使用しているのですが、どこか見落としている可能性が高いようですね。作業工程、試薬含めてもう一度、１つずつ確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.268-13 - 2012/03/11 (日) 20:23:22 - 反リア充 これはブロッティングまではとりあえずいけてる。なのでそれ以降になにかあるな、たぶん。１次抗体 and/or 2次抗体の取り違えとか。たとえば種とかどうよ、anti-mouse IgGをつかうところをanti-rabbit IgGつかってるとか、そういうの。それとか標識とか違うのを間違えて使ってるとか、たとえばHRP標識使うのをなのを蛍光標識とか。で、とれあえず, いくらなんでもそんなことは---、というなら、こういうことはどうよ。、同じ名前の抗体や検出試薬が複数あって、古いのと、あたらしいのとか、会社違うとかそういうので、どっちかが駄目で、残念なことにいつもそっち使ってたとかそういうの。先生がどれ使ってるか、（ここが大事なんだが）紙や口頭でなくて、ここにあるこのチューブだよみたく、実物指して示してもらった方がいい。 前任者からの仕事の引き継いだばかりのときに、なんかウェスタンのデータ再現出来ないんだけど、とかいうとき、これが原因のことは意外と多いんだ。みんなあんまり言わないけどね。

(無題) 削除/引用 No.268-12 - 2012/03/10 (土) 06:13:50 - あい もし問題が少なそうであれば、どこかに写真をアップロードしてしまってはいかが？許可なしでそんなことしたら、ちょっと問題かなぁ。 たとえば、http://imm.io/とか？ ところで、話がそれますが、CCDカメラで検出できる分子量マーカーってどんなものを使用されているのですか？興味があります。

(無題) 削除/引用 No.268-11 - 2012/03/10 (土) 03:27:34 - 直輝 ノンスペのバンドが先生と同じように出ているかは非常に重要ですね。 ハイブリバックに入れている一次抗体の液量は先生と同じですか？多めですか？ ⇒上手な人は少ない液量でできるけど、慣れていない人には難しいから、先生よりも多めでやった方が良いのでは？

(無題) 削除/引用 No.268-10 - 2012/03/09 (金) 11:57:35 - ~ �@>サンプルの２０〜３０KDaに出るはずのバンドのみ検出できない �A>私ではほぼ無い �B>汚れでよく見られるようなまだら模様等は見られません。 それぞれは異なる結果を表現しており、全体としてどのような結果が出ているのかが分かりません。 �@では、わざわざ"のみ"をつけていますので、目的のバンドはシグナルがなく、それ以外に非特異バンドのシグナルが出ているということでしょうか？ �Aでは、"ほぼ"ですので、目的バンドのシグナルが僅かにあることになります。 �Bこれは、シグナルが全く無いという意味でしょうか？それとも、非特異バンドのシグナルはあるが、まだら模様はないということですか？ 非特異バンドのシグナルはあるが目的バンドが出ないというのと、 全く何もでていないというのでは、予想されるトラブル原因が変わってくるでしょう。 非特異バンド、バックグラウンドにも全くシグナルが無いのであれば、ウォーリーをさがせ！？さんの書かれているNaN3の残存は有力候補だと思います。 間違えて、二次抗体反応以降でアジ化ナトリウム入りバッファーで洗っていたりしていませんか？ １．サンプル ２．試薬（バッファー、抗体等） ３．機器（設定を含む） ４．操作 位がチェック項目だと思います。 １は >同じサンプルを使用しても で消えるとして、 ２はまだ抗体以外が先生の操作や他の抗体使用時に同じボトルを使用しているとは書かれていませんね。 ３も、同時に測定していない以上、消せませんね。 先生と一緒にやるのもいいですが、自分で他の抗体では出来ているのですから、 ポカミスの可能性は自分でも潰せるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.268-9 - 2012/03/09 (金) 11:02:17 - ｂｎ 皆様ありがとうございます。大変助かります。 お忙しい先生なのにこれまで何度か見てもらい、問題も基本的すぎるのでこれ以上お願いできず、こちらに質問してみた次第です。 やはり先生にお願いし、問題がわかるまで一工程ずつ調べていくしかないようですね。 ウォーリーをさがせ！？様＞ 抗体反応の工程は、1つのプラスチックケースで行っており、メンブレンは触っていません。 具体的な結果としては、マーカーは通常通りに検出されるのですが、サンプルの２０〜３０KDaに出るはずのバンドのみ検出できないという状況です。 先生と私の結果は、バンドが薄い濃いといった違いでなく、先生ではハッキリ出るバンドが、私ではほぼ無いという状況です。 汚れでよく見られるようなまだら模様等は見られません。 み様＞ 同じサンプルを使用しても私だけ検出できない状況です。 提案いただいた方法含め、先生と相談してみます。 Harmonia様、ｗｂ様＞ 先生には全ての工程を見ていただきました。 先生には2回検出していただき、私は3回検出できない状態が続いています。 検出は同時ではありませんが、CCDカメラで同じ撮影条件で検出しています。 う様＞ ご指摘のとおりかと思います。 ただ、失敗している箇所の可能性をできるだけ検討するために、 他の人からアドバイスを頂きたく、質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.268-8 - 2012/03/08 (木) 23:52:31 - ウォーリーをさがせ！？ 難問ですね（笑） ピンセットかなあ。 もし１次抗体にNaN3が含まれているならば、 １次抗体反応後、ピンセットを使ってメンブレンを取り出して、メンブレンは洗浄しても、 ピンセットは洗わないまま、２次抗体反応の為にメンブレンをつまんでしまい、 NaN3が２次抗体反応に混入、ＨＲＰを失活させてしまっているとか。。。 他には、 各抗体反応後の洗浄時に使っている容器が汚れているとか？ 検出できないというのは、具体的にはどういった結果になっているのでしょうか？ 真白でなにも見えないのでしょうか？ 反対に、バックが高くて真黒くろすけなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.268-7 - 2012/03/08 (木) 22:03:06 - み とりあえず先生にトランスファーまでやってもらった２枚のメンブレンのうち１枚をあなたが、他方を先生がWB発色。 逆にあなたがトランスファーまでやった２枚のうち１枚を先生が発色。他方をあなたが発色。 泳動しているサンプルが先生のものとあなたのもので違うとかそういう問題じゃないですよね？

(無題) 削除/引用 No.268-6 - 2012/03/08 (木) 20:30:23 - Harmonia 先生にお願いして、徹底的に検証してもらいましょう。 たとえば、工程の１段階だけをあなたがやって、ほかは先生がやるということを各工程について（転写以降のみでいいです）やってもらうとか。 あなたがやることすべてでだめなら、あきらめもつきますが、検出できる他の抗体があるというところが、分かりにくいです。 書かれている内容では、問題が見つけられませんが、厳密にすべてを見ていただいているのでしょうか？ 検出時も、メンブレンを並べて同時に検出しているのでしょうね？ 「できない」ということの再現性は何回ぐらい？

(無題) 削除/引用 No.268-5 - 2012/03/08 (木) 19:33:03 - wb 検出器がどういうものなのか分かりませんが、単に露光時間が短いだけではないですか？

(無題) 削除/引用 No.268-4 - 2012/03/08 (木) 19:28:10 - う 話の腰をおるようで申し訳ないですが、 実際に見た先生でもわからなかったことを、 ここで文面だけの情報からアドバイスをするのは かなりむずかしいのではないでしょうか？ もう一度、実際に先生に見てもらいながら、 まーーーーーーったく同じ作業をした。 と、120%言えるように、密着で実験するしかないのでは？

(無題) 削除/引用 No.268-3 - 2012/03/08 (木) 17:11:49 - ｂｎ 回答ありがとうございます。 抗体については、1次抗体・2次抗体とも4℃保存で、 私も先生も同じチューブから取っています。 転写の確認についてはご指摘のとおり、私が転写したメンブレンで先生が検出できています。 マーカーは検出できていますので、 1次抗体の入れ忘れや2次抗体の間違いなど単純ミスしか考えられないのですが、確認しながら初めからやり直しても同じ結果が続き、大変困っています。

(無題) 削除/引用 No.268-2 - 2012/03/08 (木) 15:59:02 - ~ >他の抗体では問題なく検出できています。 初心者ではありませんので、試薬の取り違えや作業間違いなど単純ミスではないですよね。 まずは、一次抗体はどのように管理されていますか？ 貴方の小分けした抗体が死んでいて、先生の抗体が生きているだけかもしれません。 >転写までは問題ないことを確認しています 貴方の作製したメンブレンで、先生が目的タンパク質を検出できた、という確認方法でしょうか？ 確認は泳動するタンパク質を得た材料にまで遡る必要があるかと思います。 かなり無茶な操作ですが、例えば抗目的タンパク質抗体と抗アクチン抗体を混ぜて反応させたら、アクチンのみが検出されるのでしょうか。 それとも、アクチンも検出できなくなるのでしょうか？ アクチンのみが検出されるのであれば、一次抗体（か洗浄条件？）の問題と考えてもいいのではないでしょうか。

ウェスタンでの基本的なトラブル 削除/引用 No.268-1 - 2012/03/08 (木) 13:56:03 - ｂｎ いつも参考にさせていただいています。 ウェスタンで特定の抗体を使用した際に、私だけ目的タンパクが検出できず困っています。 先生が同じサンプル・試薬・機器・プロトコールで行うと検出されるため、明らかに私の手技が問題なのですが、先生に見て頂いても特に問題となる工程が見当たりません。また、他の抗体では問題なく検出できています。 主なプロトコールは次のとおりです。 PVDF膜へ転写→4%ブロックエース 室温１ｈ→洗浄10分3回→1次抗体 4℃ o/n（ハイブリバック）→洗浄10分3回→2次抗体 室温１ｈ→洗浄10分3回→検出（ECL Prime） 転写までは問題ないことを確認していますし、検出は検出器です。 洗浄の強度や抗体の液量など、メーカーのトラブルシューティングに出ている箇所は注意しましたが、毎回検出できず困っています。 基本的なことで申し訳ありません。手技的なことですので文章では問題がわからないかもしれませんが、大変困っているので質問させていただきました。原因として思い当たる点や、アドバイスを頂けたら助かります。ご指導よろしくお願いします。

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