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(無題) 削除/引用 No.2633-8 - 2019/07/27 (土) 02:48:35 - 1 使用経験はありませんが、みずぶとりりくんはどうでしょうか。 そのほか、凍結乾燥も使えると思います。（スピードバックによる凍結乾固ではなでので注意）

(無題) 削除/引用 No.2633-7 - 2019/07/27 (土) 01:01:40 - おお 活性を測っているということなので、強力な変性剤は使えないのでは？特にUreaとか。ただマイルドなDetergentは使ってみてもいいのかもしれません。 溶けにくいといいますが、まず目的の蛋白が効率よく溶けていれば全体の溶解度が悪くても何ら問題はないです。 こういう抽出にはバッファーのpHや塩濃度、加える塩、そのた添加物（EDTAとかDTTとか、、、）で大きく違うこともあります。ただ試行錯誤で袋小路から抜け出せなくなることもあります。 もしかしたら、溶解しやすいように何らかのキャリアーを使えるのかもしれません。例えばグリセロールを加えてアセトンで沈殿させて、アセトンで洗い流さなければ、沈殿はグリセロールをまだ含んでるわけだし半溶液というかそんな状態になっているわけで、更にグリセロールは飛びにくいので感想の心配もなくなる。 アセトン以外の方法だと硫安というてもあるかと。

(無題) 削除/引用 No.2633-6 - 2019/07/27 (土) 00:13:45 - l アセトン沈殿は乾燥させてしまうと非常に再溶解しにくくなり、しばしば完全な可溶化は絶望的なこともあります。加減が難しいのですが、とりあえずまだやや湿っぽい感じのうちに変性剤を含む溶液に懸濁してください。2-DならUrea、CHAPS, TritonX100, NP40などがあると思いますが、強い変性可溶化能のあるチオ尿素（２M前後)も使えます。（ただしその場合は、タンパク質濃度定量にBCA法は使えません） 沈殿法ではなく、スピンカラムなどを用いた限外濾過による濃縮もあります（アミコンなど）。心配される濾過膜への吸着ロスも以前と比べるとかなり改善されているようなので、試す価値はあるように思います。

酵素の精製 削除/引用 No.2633-5 - 2019/07/26 (金) 12:08:15 - タンパク質実験初心者 M1で実験をしています。 微生物が産生する細胞外リパーゼの精製を行っています。 微生物を培養する際に油を培地に添加するため、培養後、培養上清から粗酵素の調製は、アセトン沈殿で行っています。アセトン沈殿を行った後、緩衝液にタンパクを溶解し、イオン交換カラムに通し、その後、サイズ排除カラムで精製を進める予定です。 一つ目の質問です。 アセトン沈殿する前後の酵素活性は確認しています。 アセトン沈殿後、沈殿物がトリス緩衝液にほとんど溶解できていません。室温でボルテックスを長く１０分ほどおこなっても、全く解けないのですが、溶解するためのコツなどはありますでしょうか？（HPLCを他大学に借りに行っているので、アセトン沈殿の状態で大学を移動し、HPLC操作直前に沈殿物を緩衝液に溶解しています。アセトン沈殿は乾燥させすぎないと注意されていますので、アセトン沈殿後沈殿物を緩衝液で溶解し、溶液の状態で大学の移動を行ったほうがよろしいでしょうか？） ２つ目の質問です。 タンパク質濃縮の方法には、いろいろとございますが、アセトン沈殿で行うと、培地成分の油も除去することができ、この方法を用いています。ただ、酵素活性が落ちるので、その点、他に良い方法があれば、教えていただきたく、よろしくお願いします。ちなみに、硫安沈殿を行うと、サンプル遠心後、溶液が二層に分かれ、上層に油が、下層に水溶液が、その中間にタンパク質の沈殿物があり、タンパク質の回収が大変困難でした。 ３つ目です。 アセトン沈殿を行った後、緩衝液に沈殿物を溶解し、イオン交換カラムに通したのち、酵素活性のあるフラクションを回収、アミコンで濃縮していますが、アミコンでの濃縮後に、酵素活性が全くなくなってしまうことが多いです(280nmの吸光度によるタンパク質の濃度測定でも、数値が極端に減ります）。アミコンの操作で、タンパク質回収のコツなどがございますでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2633-4 - 2013/12/09 (月) 04:02:10 - おお >[Re:1] kkoommuuさんは書きました : > いつも教えて頂いてありがとうございます。 > > 1.5ug/ulでBCAで測定したタンパク溶液1mlを3.0ug/ulにしたいので上記沈殿を施行してpelletをlysis500ulに溶解しなおそうとしましたが、なかなか溶けません。ずっとボルテックスしても残るので、仕方なく遠沈して上清をa280測定してみると、約3.000との結果になりました。 違う測定方法で違う結果が出る可能性はいつも考慮しておかないといけないと思います。まあ濃くなってるかもしれませんけど >pellet結構捨てる感じだったので、期待していなかったのですが、、あのpelletはタンパクではないこともあるのでしょうか？ 蛋白でないかもしれませんし、たんぱくかもしれません。そもそももとのサンプルに何があったのかわからないと答えを導きようがないんじゃないでしょうか。 > > あと、再溶解するときはSDSのバッファーに溶かしてしまって、70度くらいにすて溶かすとよく見かけますが、、、先ほどのlysisに溶かして残ったpelletを溶かすために70度くらいに温めてそれを冷凍で保管してよいものでしょうか。。 その下流の実験次第じゃないですか。IEFにはSDSはつかえませんね。そう言うことを考慮した上でそういているのだったらまあ想像できる下流の実験においては大丈夫だと思いますけど

(無題) 削除/引用 No.2633-3 - 2013/12/08 (日) 22:47:29 - qq ＞上清をa280測定してみると、約3.000との結果になりました。 タンパク溶液はlysis bufferで作成されているのでしょうから、上清にはlysis bufferのtritonX100かnp40がかなり来ます。tritonやnpはA280nmの吸収もタップリありますから、上清のa280がタンパクを意味するとは思えません。 沈殿を何に溶かすかは、沈殿を何に使うかに依ります。 SDS-PAGEに使うだけであれば、直接、SDSで溶解するでしょう。それでも上手く溶けないようであれば、SDS+Ureaで溶解します。CHAPS＋UREA（IEFの条件）の選択肢もあるかもしれません。 ところで、本当に3ug/ulにする必要があるのでしょうか？

TCAアセトン沈殿の再溶解 削除/引用 No.2633-1 - 2013/12/08 (日) 17:59:31 - kkoommuu いつも教えて頂いてありがとうございます。 1.5ug/ulでBCAで測定したタンパク溶液1mlを3.0ug/ulにしたいので上記沈殿を施行してpelletをlysis500ulに溶解しなおそうとしましたが、なかなか溶けません。ずっとボルテックスしても残るので、仕方なく遠沈して上清をa280測定してみると、約3.000との結果になりました。pellet結構捨てる感じだったので、期待していなかったのですが、、あのpelletはタンパクではないこともあるのでしょうか？ あと、再溶解するときはSDSのバッファーに溶かしてしまって、70度くらいにすて溶かすとよく見かけますが、、、先ほどのlysisに溶かして残ったpelletを溶かすために70度くらいに温めてそれを冷凍で保管してよいものでしょうか。。 宜しくお願いいたします。

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