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(無題) 削除/引用 No.2619-4 - 2013/12/12 (木) 11:37:19 - 安定発現株 おおさん、U２さん お返事いただけたのに返信が遅くなりすみません。 >>通常のトランスフェクションで薬剤選択する場合は、クローニングしないと高発現株を得るのは難しいかもしれません。バルクで耐性細胞を選択した場合は、増殖に最適化した発現レベルの細胞がドミナントになると思われ、高発現が必ずしも増殖をサポートするとは限らない（かえって増殖を阻害する可能性もあります）ので。 非常に勉強になります。 今のところシングルクローンは取らずにバルクで耐性株を取ってこようと考えていますが、増殖に最適化した発現レベルの細胞がドミナントになるというのは、ベクターによって発現するタンパクによって増殖に影響が出る可能性以外のことを指すのでしょうか？つまり純粋に細胞増殖が活発な細胞では目的のベクター由来の発現が低い可能性もあるということでしょうか？ ２、３個という表現は良くないですね、スミマセン。。 言いたかったのは、２、３種類別々のレンチウイルスベクターを感染させたときと言うことです。仰る通り、コントロールはしっかり取らないといけないと思いますのでこの実験に関してはもう少し考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.2619-3 - 2013/12/05 (木) 07:53:26 - U2 単純にできるだけ高発現の細胞を得たいのであれば、レンチでインフェクションの方が良いと思います。MOIを上げればマルチコピーでゲノムにインテグレートします。 通常のトランスフェクションで薬剤選択する場合は、クローニングしないと高発現株を得るのは難しいかもしれません。バルクで耐性細胞を選択した場合は、増殖に最適化した発現レベルの細胞がドミナントになると思われ、高発現が必ずしも増殖をサポートするとは限らない（かえって増殖を阻害する可能性もあります）ので。 耐性遺伝子については、ネオマイシンよりはピューロマイシンの方が良いと思います。 レンチはゲノムにインテグレートするので、インテグレーション部位の近辺の遺伝子発現に何らかの影響が出るのはさけられません。よって、複数のウイルスベクターをインフェクションした場合も、MOIを上げてマルチコピーでインフェクションした場合も、その影響が大きくなると思われます。ただし、クローンを釣る必要がないので、異なる部位にインテグレートした個々の細胞の集合体となるので、全体としては相殺されて問題ないかもしれません。複数のベクターをインフェクションした後、クローンを拾う予定なのであれば、注意が必要と思われます。

(無題) 削除/引用 No.2619-2 - 2013/12/04 (水) 13:32:44 - おお リポソーム系とかで入りにくく、なおかつレンチと相性がいいなら、レンチのほうがいいでしょうね。 レンチいれて薬剤耐性でセレクションもできるんじゃないかとはおもうけど感染効率によってはどこまでいみがあるか。 よく入ればどっちもどっちポイけど。というのは強いプロモーターをいれてもメチル化などが問題になってくることも多いので、どっかで頭打ちするか、逆効果になるか。 > > あと、複数のベクターを持った細胞を作製しようとしたとき、異なる薬剤耐性遺伝子を持ったベクターをそれぞれ用意しないといけないと思います。その際、ネオマイシンやハイグロマイシン、ブラストサイジンなどありますが、中でも○○はあまり良くないなどあるのでしょうか？ ネオマイシンは薬剤濃度がを考えるとコストパフォーマンスはそんなによくなかったような気がします。セレクションに少しじがんがかかりますが、ブラストサイジンのほうがセレクションがはやくすむという売り込み文句を聞いたことがあったような気がします。多分そのとおりだと思います。ハイグロもそんなに難しいと思ったことはありません。 > > また、レンチウイルスベクターを２、３、４個…と感染させて安定発現株を作製したとき、個数に応じて細胞に何らかの悪影響が出ることなどがあるのでしょうか？ 2個、３個とかよく分からない表現ですが、、、感染によって何か影響を受けていることは確実なので、コントロールとか実験系をよく考えるべきではないでしょうか。 複数の遺伝子をいれるなら確かにいろいろなマーカーで選択していかないといけないかもしれませんし、そうしている実験はまあ見かけます。 工夫するなら IRESをりようしたり、 dualの発現ベクターも売っていたようなきがしますので、そういうのをつかえば手間が省けるかもしれません。発現量比の違うものを取るとかだとちょっと難しくなってくるかもしれませんけど。

薬剤セレクションもしくはレンチによる安定発現株の作製 削除/引用 No.2619-1 - 2013/12/04 (水) 13:06:08 - 安定発現株 薬剤セレクションによる通常の安定発現株とレンチウイルスを感染させた細胞株では目的のタンパク発現はどちらが強いのでしょうか？ （プロモーターは共に同じものと考えて） やはりMOIを上げればレンチの方が発現量を稼げるということで良いのでしょうか？ あと、複数のベクターを持った細胞を作製しようとしたとき、異なる薬剤耐性遺伝子を持ったベクターをそれぞれ用意しないといけないと思います。その際、ネオマイシンやハイグロマイシン、ブラストサイジンなどありますが、中でも○○はあまり良くないなどあるのでしょうか？ また、レンチウイルスベクターを２、３、４個…と感染させて安定発現株を作製したとき、個数に応じて細胞に何らかの悪影響が出ることなどがあるのでしょうか？ よろしくお願いします。

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