BioTechnicalフォーラム [WB, after transfer]

WB, after transfer

No.2607-TOPIC - 2013/11/29 (金) 04:34:52 - おお

WBでトランスファー後直ぐに WBしないばあい、みなさんは膜をどのようにしているでしょうか。

乾燥させておいておく。

PBSTにいれて冷蔵庫

ブロッキングバッファーにいれ冷蔵

PBSTであらってから凍結

Transfer buffer中で冷蔵庫(このばあいバッファーのそせいはなんでしょう)

20%メタノール中で冷蔵庫

そのた

などおもいつくのですが、みなさんのご経験など教えてください。
　

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No.2607-7 - 2013/11/29 (金) 15:16:27 - おお

みなさんありがとうございます。Iさん、詳細の突っ込みどうもです。

やはり質問が言葉足らずになっちゃいますね。普段質問に対してこれじゃあわからないと文句ばっかり垂れてますが。

みずで一日くらいおいておくというのはやったことがあります。ミルクをいれたブロッキングの状態でもやったことがあります。ふだん苦労なく検出できるものはまず大丈夫でした。

数日とかのばあいはニトロセルロースのばあいはPonceau S染色してかわかした状態でなにかプラスティックファイルポケットとかそんなものにいれて冷蔵庫か、長期なら冷凍。

PVDFは昔は乾燥させてましたが(すぐ使うときも)どうも感度が一定しないことがあるので、いま長期保存するとしたら、単なる水ですすいで凍らせるでしょうね。

でそんなバックグランドのなかで、ふとおもったのですが、WBの過程でマーカーとか若干でも薄くなるので、PBST/TBSTあるいは水につけておいただけでもチョットずつおちていくものがあるんじゃないかとおもいはじめました。

でとくに少しでも感度を損なうと検出できなくなりそうなものだと、それでいいのかなあと思い始めました。先日20%メタノールの水で冷蔵保存したのですが、検出は特に難しいものを見たわけでもないので良好でしたが、、、

ということで経験を伺っていく中でそう言う話も聞けないだろうかとおもったわけです。

(無題)

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No.2607-6 - 2013/11/29 (金) 12:36:55 - TS

おおさん？Iさん？

さっきも書いたつもりでしたがわかりにくかったですね。

TBSTですすいで、水気を切って、小さなパウチ（ZIP-Lockみたいな）に入れて、
-30℃に入れています。
後日リプローブする予定のメンブレンも同様に保存しますが、問題は特に起きません。

(無題)

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No.2607-5 - 2013/11/29 (金) 12:11:32 - I

TSさん、まっくろんさん

翌日やるならTBSTってのは良くわかります。
では一週間、またそれ以上先にやるときはどのようにストップさせるのが良いでしょうか？

普通は連続して実験するのがベストだと思いますが、学生を指導する際はどうしてもできないことがあるので是非ご指導ください。

よろしくおねがいいたします

(無題)

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No.2607-4 - 2013/11/29 (金) 10:25:40 - まっくろん

　次の日に行う場合は，TBS-Tで冷蔵。数日あける場合は乾燥させて，WB時に再メタノールか，ミリポアが公開しているrapid immunodetectionです。但し，本実験の場合は方法を変えたくないので，スケジュール通り行うことを基本にしています。

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No.2607-3 - 2013/11/29 (金) 09:13:39 - TS

次の日に進めるならTBSTで冷蔵です。

それ以外は、TBSTですすいで冷凍しちゃいます。
困ったことないし、冷蔵よりも安心なので。

(無題)

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No.2607-2 - 2013/11/29 (金) 08:58:33 - K

数日ならブロッキングバッファーにいれ冷蔵にしてます。
スキムミルクが腐るので出来るだけ2,3日に1回は交換しています。
アザイド入れとけば交換不要な気もしますが、
ペルオキシダーゼで検出だとちょっと気になりますので（その時点で残ってないから大丈夫なんだろうけど）