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(無題) 削除/引用 No.2598-10 - 2013/11/27 (水) 17:26:45 - assu kodamataroさん ご意見ありがとうございます。 ピペットが足りなかったこともあり、新たに注文していますのでそちらを使用してみます。 泳動で使うピペットと分ける必要があることは、初めて知りました。 勉強になります。 ありがとうございます。 その他、チップやチューブの件も購入等考えてみます。 貴重なご意見ありがとうございました。 再度チャレンジしてみて問題がありましたらコメントいたします。 みなさんありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2598-9 - 2013/11/27 (水) 16:23:09 - kodamataro 電気泳動ピペットと、PCR反応液を組み立てるのピペットは必ず別々にしなければなりません。 ピペットからの汚染というのは非常に多いのです。 フィルターチップは液の逆流によるピペットの破損を防ぐ効果はありますが、核酸を通過させない保証はありません。 これは私も同様の問題が生じたことがあり、メーカーに確認致しました。 ご自身の購入元のメーカーにご確認下さい。 ピペットも含め、すべての試薬を新しくすることをお勧めします。 中途半端な交換ではまた再発します。 ついでにいうと、「オートクレーブ」を過信される方がいますが、オートクレーブは微生物学的には無菌になりますが、物理的には「蒸気で汚染」させます。 分子生物学グレードのチューブを購入した場合は、滅菌の必要はありません。 手袋には賛否両論があります。 適切なサイズを選択しないと手先の感覚が鈍り、他のチューブに触れて、ネガコンタミさせてしまう可能性があります。 今回はマウスがサンプルですので、自身のゲノムをコンタミさせてしまっても原理的には問題になりません。手先が鈍るなら着用しないという選択肢もあります。

(無題) 削除/引用 No.2598-6 - 2013/11/27 (水) 15:55:27 - assu Pumpkinさん・TSさん お返事ありがとうございます。 実は増幅曲線の立ちあがりが、template入りとほぼ変わらないのです。 Ctの差は0.5〜2程度しかありません。 そのため無視することもできずに悩んでいます。 泳動してもばっちりバンドが見えていしまい、template入りと全く変わらず予想位置に出ます。 その他ありましたら教えて頂けますと助かります。

(無題) 削除/引用 No.2598-5 - 2013/11/27 (水) 15:40:15 - TS Pumpkinさんのご指摘にもありますが、 SYBR greenだし、NCTとサンプルとのCt値の差がどれほどあるか、というのはどうでしょう。 十分に差が大きければ、Negligibleと考えることもできる思います。

(無題) 削除/引用 No.2598-4 - 2013/11/27 (水) 14:59:00 - Pumpkin ネガティブコントロールでも増幅曲線が立ち上がり、 融解曲線も同じ位置にくるとのことですが、 ポジティブコントロールやサンプルと比較して、 立ち上がりのサイクル数や蛍光強度はどんなもんでしょうか？ また、ネガティブコントロールをQPCR後に電気泳動しても、 ばっちり、かつ予想位置にバンドが見えるんですか？ 全ての試薬を新しくしているということなので、 上記質問です。ピペットマンはバリアチップを使っていれば、 大丈夫でしょう。

(無題) 削除/引用 No.2598-3 - 2013/11/27 (水) 14:54:31 - assu Pumpkinさん お返事ありがとうございます。 滅菌水も滅菌後分注して凍結してあるものを使用しており、毎回新しい物を解凍しています。 この分注した滅菌水は共通で使用していますので、分注時点でのコンタミは無いかと思います。 しかし、怪しいので、再度新しく作成したいと思います。 全ての物は一応新しくしています。 あとはピッペットマンぐらいです… 泳動してみるとやはりバンドがtemplate入りと同じところに出てしまいます。 再度全てのものを新しくしてみます。 ありがとうございます。

コンタミ 削除/引用 No.2598-2 - 2013/11/27 (水) 14:28:26 - Pumpkin コンタミ。 使用していた全ての物を新品に。 もちろん、滅菌水も。 QPCR後に産物を電気泳動してますよね？ ここが、最大の汚染源かと。

リアルタイムPCRについて 削除/引用 No.2598-1 - 2013/11/27 (水) 14:20:06 - assu 初めて書き込みさせていただきます。 修士１年の学生です。 現在マウスの始原生殖細胞でp21、p27のmRNA量解析を行っています。 解析はリアルタイムPCRで行っているのですが、この1か月間、NCTでも増幅曲線が立ち上がるという問題が起きています。 Dissociation Curveを確認してみますと、primerの目的産物と同じ温度でのピークが見られます。 初めはcDNAのコンタミかと思いまして、現在まで以下の点を改善しました。 ・グローブをつける ・フィルター付きチップを使う ・滅菌水を使う ・primer配列を見直す（これまで4つ作成） ・primerの希釈のやり直し（100uMから10uMへ希釈） このほか極力コンタミの無いように操作しているつもりです。 ですが全く改善されませんので、みなさんにお尋ねしようと思いました。 試薬はPower SYBR mastermix を使用しています。 こちらも新しいものに変えました。 何か不足の点がありましたら随時書き込みます。 どうぞよろしくお願いいたします。

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