BioTechnicalフォーラム [核を抽出できない]

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(無題)

No.2595-11 - 2013/11/28 (木) 11:14:06 - SORA

qq様
ご指摘ありがとうございます。
仰る通りでした。
私がホモジネートでさしたのは、注射筒でのホモジナイズのことでした。
すいません。

(無題)

No.2595-10 - 2013/11/28 (木) 09:11:57 - qq

あげ足取りみたいではあるけれど、言葉の概念はそこそこ重要なので、
＞ホモジネートより超音波が良い
ホモジネート：ホモジナイズしたもの
超音波（破砕）：超音波発生装置で組織（細胞）を均一に破砕（ホモジナイズ）すること。ここでは、ホモジナイズの方法の１つ。
「ダウンスホモジナイザーより超音波が良い。」とか「酵素処理より超音波が良い」であれば理解できる。

(無題)

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No.2595-9 - 2013/11/27 (水) 19:56:00 - SORA

おお様

なるほどです。
Cytosolの検討とともにデブリスの方の検討も加えてやってみようと思います。

検討の結果、まだ上手くいかないようであれば再度質問させていただくかもしれません。
有難うございました。

もし核抽出の際におさえておいた方がいいポイントなどありましたら教えていただけると幸いです。
たとえば、Nuclearの抽出の際はホモジネートより超音波が良いor悪いなど
宜しくお願い致します。

(無題)

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No.2595-8 - 2013/11/27 (水) 14:42:50 - おお

>[Re:7] SORAさんは書きました :
> おお様
>
> 勉強不足で申し訳ないのですが、「不溶物をとっておき、さらに可溶化」とは核抽出処理後の遠心にて上清をNuclear fractionとして扱っていますが、その時のデブリスにさらにRipaなどの可溶化剤を加えるという意味でしょうか？
> このときのさらに可溶化したものは何を示しているのでしょうか？
> 大変申し訳ないのですが、ご教授いただければと思います。

抽出が不完全なら、そのデブリにのこってますよね、という単純なことなんですけど。

核抽出にもいろいろあるんですが、大抵クロマチンの構成蛋白は溶出しにくいような条件を使うことが多いと思います。ということはお使いのプロとコールの抽出がうまくいっていたとしてもある種蛋白はデブリのほうにいってしまってもおかしくないとおもいます。

(無題)

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No.2595-7 - 2013/11/27 (水) 14:08:07 - SORA

おお様

勉強不足で申し訳ないのですが、「不溶物をとっておき、さらに可溶化」とは核抽出処理後の遠心にて上清をNuclear fractionとして扱っていますが、その時のデブリスにさらにRipaなどの可溶化剤を加えるという意味でしょうか？
このときのさらに可溶化したものは何を示しているのでしょうか？
大変申し訳ないのですが、ご教授いただければと思います。

(無題)

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No.2595-6 - 2013/11/27 (水) 01:21:23 - おお

>[Re:5] SORAさんは書きました :

> NuclearへのActinの漏れこみは他の方の書き込みにもある通り多少なりとも生じてくるのでは、、、と思っていましたが、他のWholecellに存在するProteinの検出の際のActinとほぼ同等の検出率です。この結果をみるとやはり、そもそも核抽出自体ができていないのではないとも思ってしまいます。

なるほど。でもですよ。さいとぞるが除けてないとしても核蛋白はみえる可能性はありますよね。あと核抽出後のえんしんして不溶物を除くと思いますが、それもとっておいて、そこからRIPAとか強めのバッファーで蛋白抽出を行ってWBをすれば抽出されてないかどうかわかるとおもいます。

(無題)

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No.2595-5 - 2013/11/26 (火) 22:58:27 - SORA

おお様
有難うございます。

核抽出操作を始めて間もないころは（Kitを使ってた時）、顕微鏡での確認も行っていましたが、最近は怠っていました。Sample調製の際に初心に戻って再度顕微鏡での確認をやってみます。

NuclearへのActinの漏れこみは他の方の書き込みにもある通り多少なりとも生じてくるのでは、、、と思っていましたが、他のWholecellに存在するProteinの検出の際のActinとほぼ同等の検出率です。この結果をみるとやはり、そもそも核抽出自体ができていないのではないとも思ってしまいます。

有難うございました。

(無題)

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No.2595-4 - 2013/11/26 (火) 17:02:01 - おお

核にもアクチンのパラログがそんざいします。今回それをひっかけているか不明ですが、アクチンは細胞(質)に大量にあるので微量の混入がwesternという感度のいい検出方法で検出できても不思議ではないです。サイトゾルと分けたとき核がちゃんと顕微鏡でみれるかとかも確認できたらやっておいた方がいいかもしれません。あと蛋白量的にはどうでしょうか。
目的のタンパク質が抽出されないのか、核抽出がうまくいってないのか、、、抗体の評価も待たないといけないので、そういったところも少し見て整理していった方がいいかもしれません。

(無題)

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No.2595-3 - 2013/11/26 (火) 15:27:20 - SORA

コン様
早速のお返事有難うございます。

確かにWholecell lysateで検出できるかどうか確認してみる必要がありますね！
早速試してみます。

これで検出できなければ抗体を購入する方向で教授と話をしてみます。

ありがとうございました。

(無題)

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No.2595-2 - 2013/11/26 (火) 12:21:57 - コン

Whole cell lysateとcytoplasmic fractionを一緒に流して、少なくともwhole cell lysateで検出できないのであれば、抗体の反応条件（もしくは抗体そのもの）が悪いのでしょうね。確認してますか？
actinについては、多少出てもおかしくはないと思いますが、cytoplasmic fractionと比較してどうですか？

核を抽出できない

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No.2595-1 - 2013/11/26 (火) 10:46:32 - SORA

こんにちは。
いつもお世話になっております。

核内の転写因子の発現量の検出、細胞質での発現量との比較をしたく、NuclearとCytosolを分けてSampleを調製する必要があります。

初めはELISAのkit（Active motif）を購入した時にまとめて購入したNuclear extract kit（Active motif）を用いて抽出していました。
このkitを用いたELISAの結果はポジコンにおいて確認済みなので問題ないとは思うのですが、そのkitを使って核を抽出後、WBをやるとどうも検出されません。この検出されないというのは、目的の転写因子でけでなく標準物質のLaminB1も検出されないのです（ほぼ何も写真に写りこまない）。
kitとWBの相性が悪いのだと思い、論文やここでの書き込み、ネット上のプロトコールなどを参考に幾度となく挑戦しましたが、検出できません。
また、抗体が悪いのではないかと思い、現在使用しているサンタクルズのではない抗体の購入も検討していますが、そもそもの問題として核抽出したものをActinで染めてみると、Actinが検出されてしまうのです。

培養細胞での検討ですが、使用しているプロトコール、上手くいくような仕掛け、トリックがありましたら教えていただければ幸いです。また、同様の経験をされた方がおりましたら、どのように乗り越えたか教えていただければと思います。

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