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(無題) 削除/引用 No.2594-6 - 2013/11/27 (水) 12:26:59 - おお >[Re:4] Transfectionさんは書きました : > > そんなに変になることはなかったとのことですが、1ug入れた時と0.5ugずつで入れた場合では、その遺伝子(正しくはタンパク質)の発現量はどうだったでしょうか?およそ半分になりましたでしょうか? 直接的な比較をしたことはほとんどありません。ただし論文でもプラスミドの量を振って(トータルの量をあわせた状態で)容量依存性を見ているものはまあまああると思います。 1ugとその半分0.5ugであまり顕著にさがみれなかったら、1, 0.3, 0.1ugというようなちょっと幅広い取り方でもいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2594-5 - 2013/11/27 (水) 09:50:26 - 独り言 >[Re:4] Transfectionさんは書きました : > お尋ねしたいのですが、UTR領域がある程度あれば干渉する可能性があるんでしょうか?また、そのメカニズムは?自分でも調べてみますが、もしなにkaご存じでしたら教えてください。 私は知りません。ただUTRは一般的にそのmRNA自身の翻訳に影響する例は多数あります。UTRが別のmRNAの翻訳のかどうかは、わかりかねます。

(無題) 削除/引用 No.2594-4 - 2013/11/27 (水) 07:24:36 - Transfection 独り言さん、おおさんありがとうございます。とりあえず、一種類のDNAにバックボーンベクターを混ぜてDNA総量を合わせた場合で発現量がどうなるか見てみたいと思います。 >独り言さん >UTR領域もないプラスミドでそんなことってあるんですか。 実は、この発現ベクターは人からもらったなのですが、結構な長さ(100bp超)の5'UTRが含まれています。自分で書いといてなんですが、あまりよくわからないけれども干渉がありうるのかとなぜか思ってしまいました。お尋ねしたいのですが、UTR領域がある程度あれば干渉する可能性があるんでしょうか?また、そのメカニズムは?自分でも調べてみますが、もしなにkaご存じでしたら教えてください。 >おおさん >例えば経験上ある実験で1つのプラスミドを1ugいれていて、その実験をベースに新たに違う遺伝子も導入することになり、0.5ugずつにして、合計のDNA量を以前の実験とおなじにたもって導入したりというケースがけっこうありましたが、そんなに変になることはなかったです。 そんなに変になることはなかったとのことですが、1ug入れた時と0.5ugずつで入れた場合では、その遺伝子(正しくはタンパク質)の発現量はどうだったでしょうか?およそ半分になりましたでしょうか?予定では、うち二種類の発現量の比を、入れるプラスミドの量を変えることである程度変化させた上でみたいところ(それぞれの遺伝子に共通する下流のシグナル)がどうなるかを調べることになるだろうと予測しています。なので、発現量の変化が大事になるだろうなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2594-3 - 2013/11/26 (火) 18:03:03 - おお 既に指摘がありますが、比較が必要なときはからのベクターでいいですから、とーたるのDNA量をそろえとくべきだとおもいます。DNAと試薬の比が変わるとtransfection自体の効率が変わってきます。 4ついれてその発現量があなたの実験に十分な量であれば、2つ、3つ入れて確認する必要がありますでしょうか。ただし、4つ入れた場合、やそのうち一つを抜いた場合などで発現したタンパク質の効果の比較をしないといけないなら、発現量の心配はしないといけないし、じっさいにWBで見ることになると思いますが。 例えば経験上ある実験で1つのプラスミドを1ugいれていて、その実験をベースに新たに違う遺伝子も導入することになり、0.5ugずつにして、合計のDNA量を以前の実験とおなじにたもって導入したりというケースがけっこうありましたが、そんなに変になることはなかったです。 ただし、遺伝子発現させるとそのタンパク質の影響で、ネガティブあるいはポジティブフィードバックなどがかかったり、それがほかのプラスミドから発現する蛋白に影響したりなどはあり得ると思いますので、コンビネーションで変動が見られる可能性はないわけではありません。

(無題) 削除/引用 No.2594-2 - 2013/11/26 (火) 10:05:25 - 独り言 大分違うってことはないと思うけど、単独のほうが発現良くなる事はあるとは思う。プロモーター領域が転写因子とかを取り合うとかだと思う。でもネガコンの発現が高い分には、あまり問題ないと思うけど。 でも、そんなにきにするのなら、ケチらないでちゃんと空ベクターもコトランスフェクションして、導入する総DNA量を同じにするべきだし、なんだかそれでも気になるようであれば、無関係なタンパク質を組み込んだベクターをコトランスフェクションすべきです。さらに言えば、その遺伝子の機能が欠損する変異体を作成してコトランスフェクションに使用すれば、さらによし。 >4つのうち二つは遺伝子ファミリーで、ほぼ同じ遺伝子(途中に追加のエクソンが一つ入った形をしている)です。特にこの二つで、Translational Machineryの干渉が起こったりしないか心配しています。 さすがに考え過ぎでは。UTR領域もないプラスミドでそんなことってあるんですか。

複数のDNAを細胞にトランスフェクションする際の疑問 削除/引用 No.2594-1 - 2013/11/26 (火) 07:46:42 - Transfection 細胞を扱った実験はあまり経験がありません。よろしくお願いします。 細胞(CHO cellか293cell)に複数の遺伝子をトランスフェクション試薬(FuGene6かLipofectamine2000を考えています)を用いて導入することを考えています。FuGene6の説明書を見ると、6穴プレートで1-2ugのDNAを導入できるとあるので、4種類の遺伝子を、それぞれ500ngずつ導入したいと思っています。この場合、各遺伝子の発現量は、それぞれの遺伝子を一種類だけ500ngトランスフェクションした場合の発現量とだいぶ違うものでしょうか? ボスから実験を打診された時、上記の疑問をなげかけて、一個一個の遺伝子を導入した場合や、あるいは4つのうち2つあるいは3つを発現させた場合のコントロールがいるんじゃないですか?そうすると物凄い手間が掛かって大変そうだしお金も掛かりますね、と話してみました。すると、その疑問はもっともだが、Dual Luciferase Reporter Assayなんかも二種類入れてどっちも同じように発現することを前提としたシステムで、それでキットだって売り出されている。トランスフェクションはおそらく大丈夫だろう、しかも導入効率の良い293あたりを使うわけだし、と楽観視しています。 293細胞で500ngのDNA一種類だけをトランスフェクションした場合は、95%以上の細胞が導入遺伝子を発現することはFACSで確認しています。 4つの遺伝子は全て同じバックボーンベクターなので、同じ種類のプロモーター(CMV)を持っています。 4つのうち二つは遺伝子ファミリーで、ほぼ同じ遺伝子(途中に追加のエクソンが一つ入った形をしている)です。特にこの二つで、Translational Machineryの干渉が起こったりしないか心配しています。 経験がある方、これに関して知識がある方、どうかよろしくお願いします。

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