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(無題) 削除/引用 No.2593-14 - 2014/02/03 (月) 19:47:24 - 名無し 抗体じゃないけどIsolectinはどうよ。蛍光標識したisolectin売ってるよ。 CD31は結構くせ者でね。血管の種類とかサイズとか組織とかで染まりやすいとこと、非常に染まりがわるいところとがある。一口に内皮といってもいろいろみたい。他のマーカー抗体もそういう傾向はある。

結果報告 削除/引用 No.2593-13 - 2014/02/03 (月) 11:22:08 - Dr Carter 色々条件を振ってやってみました。 その結果、CD31はAcetone, PFA, Methanolの後固定で、いずれもよく染まりました。 やはり固定前の水洗がいけなかったようです。 しかし、もともとマウスに入っているtdTomatoが、後固定だとどうしても滲んでしまうため、前固定（4%PFA over nightだとCD31が全く染まらないことを確認済み）でも条件を検討しました。 その結果、CD31の染色性は後固定よりやや落ちるものの、1%PFA 2hの前固定で両方とも満足できる結果を得ることができました。 色々とご指摘頂き、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2593-12 - 2013/12/09 (月) 17:28:51 - 組織 ちなみに私の使ってる有機系固定液の固定法です。参考まで。 薄切 風乾 アセトン・メタノール等量混合液、4度、10分 風乾 PBS洗浄 （以下、ブロッキング）

ありがとうございます。 削除/引用 No.2593-11 - 2013/12/09 (月) 17:14:36 - DrCarter ＞組織さん 確かに言われてみれば仰るとおりですね。。。 初めに教わったまま、何も考えず水洗しておりました。 是非試してみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2593-10 - 2013/12/09 (月) 08:37:33 - 組織 >[Re:9] DrCarterさんは書きました : > OCTコンパウンドに包埋して凍結保存しているため、始めに水洗していたのですが、するべきではないのでしょうか。 未固定の状態で水に漬けると、浸透圧で形態が壊れるし、切片が剥がれやすくなります。先に固定して、その後でコンパウンドを洗い落とせばいいでしょう。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2593-9 - 2013/12/08 (日) 21:14:57 - DrCarter ＞組織さん OCTコンパウンドに包埋して凍結保存しているため、始めに水洗していたのですが、するべきではないのでしょうか。アセトンやメタノール固定は試しておりませんでした。是非試してみようと思います。 ＞べーべーさん Isolectin B4はFITC conjugatedのものを試しています。確かに血管が染まるのですが、染まる血管と染まらない血管の色むらが大きいうえ、表皮や毛根などの上皮組織が強く染まってしまう（私が染めている組織は皮膚）ため、使いづらいという印象でした。

(無題) 削除/引用 No.2593-8 - 2013/12/08 (日) 18:23:12 - ぺーぺー アイソレクチンB4(IB4)って検討しましたか？

(無題) 削除/引用 No.2593-7 - 2013/12/03 (火) 09:10:19 - 組織 質問からずれますが、未固定凍結切片でいきなり水洗はしません。まず固定です。 免疫染色では固定液の選択が一番重要なので、すでに新鮮凍結のサンプルがあるなら、いくつかの固定法を試してみるのが良いと思います。 アルデヒド系と有機系で染色態度が違うことが多いです。PFAは試したということなので、有機系の固定液を試してみたらどうでしょうか。私はアセトン・メタノール等量混合液（4度、10分）をよく使っています。ただtdTomatoが固定によりどうなるかは、経験がないのでわかりません。

FITC-Dextran 削除/引用 No.2593-6 - 2013/12/03 (火) 03:54:03 - DrCarter FITC-Dextranは、血管内皮を透過しない性質を利用して血流を染めることによって、血管をイメージングするということのようです。 血管内皮細胞の染色という目的からは外れますが、それはそれで使えそうですね。

(無題) 削除/引用 No.2593-5 - 2013/12/02 (月) 05:40:35 - 独り言 目的に合致するのかわかりませんが、マウスの血管をFITC-Dextranで灌流して、固定することで、血管を染色するというのを見た事あります。dextranがメジャーなのか他の物質もあるのか良く知りませんが、確実に血管を染色できるのかなと思いました。

なるほど 削除/引用 No.2593-4 - 2013/12/02 (月) 03:07:08 - DrCarter コメントありがとうございます。 tdTomatoに関しては、未固定凍結切片だと始めの水洗時にtdTomatoが流れ落ちてしまうという報告があり、実際に試してみたところそのような印象でしたので、PFA前固定という方法をとっています。 メタノールやアセトンによる前固定というのは聞いたことがないのですが、されたことがある方はいらっしゃいますでしょうか？ CD31は曲者なのですね。確かに、その後PFAによるover nightではなく3時間固定で試してみたところ、それなりに染まりましたがムラが多いという印象でした。 凍結切片で賦活化というのはしたことがないですが、理論的に考えればアリですね。試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2593-3 - 2013/11/26 (火) 20:40:41 - 名無し CD31は以外とくせ者で、血管の種類やサイズとか組織とかの違いで、染まり方はかなりちがう。ものによってはかなり染まりにくいていうか染まらない。同じ組織片の中でもよく染まる血管と染まりにくい血管があり必ずしも均一でない。 パラフィン標本だと賦活化とかも必要だったりする。凍結でどうかは分かんないけどもしかしたらそうした処理が要るかも。他のマーカーもそういう特性はあるかもしれない。 きれいに血管が染まってる論文をさがして、抗体のメーカーとか条件とかを参照すればどうかな。

(無題) 削除/引用 No.2593-2 - 2013/11/26 (火) 11:48:23 - むー 固定したら普通Tomatoは減光するんじゃないでしょうか。GFPよりはマシだそうですが それはどうでもいいとして、普通PFA固定したから抗体が認識しなくなるということはないのでたぶん別の問題だと思います。 抗体を買った企業のHPに行けば組織免染プロトコルが載ってるはずなので一度そのプロトコルに従ってやってみてはいかがでしょう。 たぶんPFAかメタノール固定でやってるはずです

マウス血管内皮の蛍光免疫染色 削除/引用 No.2593-1 - 2013/11/26 (火) 02:19:39 - DrCarter お世話になっております。 マウス組織の凍結切片において、血管内皮の蛍光免疫染色で苦労しております。 論文で報告されているCD31, vWF, Tie1など複数の抗体に手を出しましたがうまく染まりません。 染まらない原因として考えられるのは、論文の方法と異なり、凍結前に4%PFAで一晩前固定していることです。 しかし、未固定凍結切片ですと、使用しているマウスに元々入っているtdTomatoが光らなくなってしまうため、凍結前に4%PFAで固定という条件は動かせません。 どなたかPFAで前固定するような条件でうまく染まる血管内皮特異的な抗体をご存じでしたら、ご教授頂けますと幸いです。

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