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(無題) 削除/引用 No.2585-8 - 2013/11/27 (水) 09:30:22 - AP サンプルバッファーでホモジナイズしたサンプルは（ボイル済みであっても）、タンパク質分解が進むので長期保存できません。フリーザーで凍結すればある程度もちますが、凍結融解でかなり急激にだめになります。そのへん大丈夫でしょうか。 1、2どちらの方法もありですし、論文に載せるようなデータとして使われています。 タンパク定量せずに直接1xサンプルバッファーでホモジナイズする場合、1レーンあたりショウジョウバエ1/10匹相当のライセートくらいが適当かと思います。 複数サンプル間で比較する場合、抗チュブリン抗体などで検出したバンドが同じ強度になるようにアプライ量を調整します。

(無題) 削除/引用 No.2585-7 - 2013/11/27 (水) 06:19:56 - おお 発現をみるだけならどっちでもアクセプタブルです。発言量を比較するなら、蛋白定量をしたほうが無難です。総蛋白量が問題になっているときに、あなたがどれだけ蛋白をロードしたか全くアイデアがないのが問題かと思うのですがどうでしょうか。まあそれでも蛋白定量しないというなら、ハエ一ぴきなんグラムですか? SDS sample bufferをdyeぬきで使い蛋白定量してdyeを加えるというような人もいます。BCAやローリーをつかうなら2-meやグリセロールがじゃまになるので、SDS とTrisなどだけで溶解して蛋白を はかってあとでついかするのも可能です。 もちろんRIPAなどのbufferをつかいLysisし定量後SDS sample bufferを入れてもかまいません。こちらの方が前者よりDNAとか夾雑物がへるので、場合によっては解像度がまします(きれいに流れます). リコンビナントはどれくらいの量でポジこんとしているのか、それにたいしてlysatesにはどれくらいの量見込まれるのかもよく考えた方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.2585-6 - 2013/11/27 (水) 04:09:40 - FL 前回のSDSPAGEサンプルを15倍希釈して再度Westernを行いましたが、 ほぼ全くバンドが見られませんでした。。。 ハエからのサンプル調整からやり直そうと思っているのですが、 ハエ個体からのタンパク発現をWesternで調べたいときに どのようにサンプルを調整するのがよいのでしょうか？ 以下の2通り（もしくはそれ以外）でどうするのがよい、もしくは一般的でしょうか？ 1. SDS-Sampleバッファーでいきなりホモジナイズする（volumeあたりの ハエ個体数はもう少し減らそうと思います） 2. Lysisバッファーでいったんホモジナイズして、遠心後上清（総タンパク 量の定量の後）をSDS-Sampleバッファーと混ぜる

(無題) 削除/引用 No.2585-5 - 2013/11/25 (月) 03:18:23 - FL みなさま、アドバイスありがとうございます。 サンプルは特に粘性が高かったり糸を引いていたりはしなかったのですが、 それでもゲノムDNAの可能性もあるかもしれないと思いました。 確かにオーバーロード可能性が高いかもです。 というのもハエの数が足りなくて数サンプル3-4匹/200 uLで ホモジナイズしたものは他のもっと多くのハエを用いたのよりも バンドはまだマシでした。それでもまだしっかりシャープではなかったですが。 前回のSDSPAGEサンプルを高速で遠心し、上清をとって20倍程度 希釈して再度試してみようかと思います。 ご指摘の通りタンパク量は計っていないです。 直接SDS-PAGEサンプルバッファーでホモジナイズしているので。 適当なLysisバッファーにいったんホモジナイズして、 Bradfordで定量してサンプル調整したほうがよいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2585-4 - 2013/11/24 (日) 15:03:21 - AP そうね、オーバーロードの可能性もありますね。 1レーンあたり数十u程度がいいところ、多くても100 ugというのが私の感覚ですが、10匹を200 uLでホモジナイズして15 uLをロードとなると、数百ugになりましょう。1レーンあたり1匹弱当量ですが、成虫1匹 1 mg弱ありますので。

(無題) 削除/引用 No.2585-3 - 2013/11/24 (日) 14:44:49 - おお キチンが蛋白中質の時に邪魔になるようです。経験はほとんどありませんのでそれがげんいんかだんていできないですけど。抽出のときRIPAなどをつかったことがありますが、グラスビーズ をいれて、エッペン用ホモジナイザーをつかい手動でグラスビーずが組織片を巻き込み破砕できるようにまわして、キチン質とおもわれる茶色い断片がこまかくなりみえなくなるまで、破砕をつづけました。 同じ方法をとれとはいいませんが、その辺は慎重になった方がいいかなぁとおもいました。 ビートビーたーみたいなのがあればそういうのでもいいかもしれません。すりガラスになっているホモゲナイザーでもいいかもしれません。 あと10匹で200ulですか。ちょっと蛋白量多くないですか?めだけ20ー30匹あつめてほぼ同じスケールでやりましたけど結構多かったと思います。一度オーバーロードもうたがってみてもいいかもしれませんが、、、 文面からみると蛋白量はみつもってないですよね。

(無題) 削除/引用 No.2585-2 - 2013/11/24 (日) 13:24:36 - AP 高分子量のゲノムDNAが混じっていると、それにタンパク質が引っかかってタンパク質がシャープに分離せず、彗星のように尾を引きます。サンプルをピペットで吸い上げた時、粘性が高かったり糸を引いたりしていませんか。 １）ホモジネートを強く遠心して、液面近くの少量の上清を使う。 ２）ゲノムDNAをせん断する処理をする。粘性が低くなるまで、シリンジを使って注射針に出し入れするとかソニケーターをかけるなど。

ショウジョウバエ個体からのWestern サンプル調整 削除/引用 No.2585-1 - 2013/11/24 (日) 11:05:05 - FL アダルトのショウジョウバエ個体からのWestern ブロット 用のサンプル調整について質問です。 ショウジョウバエ10匹を200 uLの2xSDS-PAGE sample buffer の中に入れ、Pestlleでホモジナイズして、95C 5minインキュベートした 後に遠心し上清を回収しました。 このサンプルを15uL SDS-PAGEにロードして一般的な方法で ゲルをランしWestern Blotしたところ、マーカーやコントロールの リコンビナントタンパクなんかはしっかりときれいなバンドを 得られたのですが、ハエサンプルのレーンはきたないバンドとも言えない スメアみたいなものしか得られませんでした。 持ちているのはTubulin抗体なのですが、ハエサンプルからでも きれいな１本のバンドが出るはずなのですが、、、、 サンプル調整の問題だと思っています。 アダルトのショウジョウバエ個体からのWestern ブロット 用のサンプル調整についてアドバイスがありましたらよろしくお願いいたします。

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