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(無題) 削除/引用 No.2583-12 - 2013/11/25 (月) 01:39:59 - おお >[Re:11] kkoommuuさんは書きました : > みなさん、ありがとうございます。 > 1、スクレーパーする前に試薬をかけて細胞膜が溶けるのを見て確認する > ２、できるだけon iceにすることで1.8mg/ml回収できました！ 蛋白が取れたんであればよかったですね。ただ、UVではかったのでしょうか。測っていたならその妥当性をどの様にお考えですか。それではかれるならそうしようという人もいるでしょうし。 > > 実はサイトにのっていたのですが、先に5%トリクロロ酢酸（研究室にこれしかなかったので、、サイトでは10%でした）を浸して氷上に30分インキュベートしたうえで、PBSで洗ってこのm-perをかけてみる、ということを試してみたのですが、m-perかけても全く細胞膜が溶けませんでした。蛋白も回収できなかったのですが、、、なんでなのか全くわかりません。御教授いただければ幸いです。 それにはあまりはっきりした理由はありません。たとえばおなじような感じでアセトンをつかってタンパク質を凝縮、沈殿させる方法は植物から酵素を抽出したりするのによくつかわれますし、筋肉ではアクチンやみおしんなどの抽出によくつかわれています。そう言うものは次のステップのバッファー(たいてい緩衝剤と塩がはいっただけ)によるリカバリーはいいです(もちろんここのタンパク質に注目すると全然取れない蛋白もあります)。 おなじようにアセトンを培養細胞でつかうとトータルのリカバリーとしては、おなじようなバッファーをつかうとあなたのやっているような感じだと思います。TCAも血清とかだとリカバリーはいいかもしれません。 TCAやacetonをつかって解けにくくなる場合やはりそれなりの工夫がいると思います。蛋白の溶解をうながすものがひつようです。界面活性剤や高い塩濃度、カオトロピックな作用を持つものなどを使うのがたいていだとおもいます。 もうひとつ。TCAをつかうとかなりのタンパク質が変性してしまいます。あなたの実験に使えるかどうかどの様に判断したのでしょうか。目的に合わせて蛋白を抽出しないと、実験になりませんから。

(無題) 削除/引用 No.2583-11 - 2013/11/24 (日) 22:58:34 - kkoommuu みなさん、ありがとうございます。 1、スクレーパーする前に試薬をかけて細胞膜が溶けるのを見て確認する ２、できるだけon iceにすることで1.8mg/ml回収できました！ 実はサイトにのっていたのですが、先に5%トリクロロ酢酸（研究室にこれしかなかったので、、サイトでは10%でした）を浸して氷上に30分インキュベートしたうえで、PBSで洗ってこのm-perをかけてみる、ということを試してみたのですが、m-perかけても全く細胞膜が溶けませんでした。蛋白も回収できなかったのですが、、、基本的にはトリクロロ酢酸によって脂質膜をとかして酸性を保つことでプロテアーゼを不活化しているので、前処置でいつもこうすればいいのかなと思って試したのですが、結果的にはm-perが全く働かなくなりました。なんでなのか全くわかりません。御教授いただければ幸いです。 色々なご指摘ありがとうございます。一つ一つ原因をつぶす感じが大事なんですね☆大変な作業ですよね！コツコツ頑張ります！！

(無題) 削除/引用 No.2583-10 - 2013/11/24 (日) 06:30:58 - mon 皆さんの意見に追加ですが。 細胞によってはスクレーパーで回収すると、細胞の物理的ダメージが大きく、それだけで細胞が破壊される（＝細胞内タンパクが流出する）ことが多いです。 Lysisする前に検鏡してみましたか？ そのため、洗浄後dishに直接lysis bufferを入れ溶解させることが多いのです。 私は、洗浄前にdishを氷上に並べ急冷してからice-cold PBSで洗浄し、氷上にやや傾けておくと余分なPBSが片方に溜まるので(500uLくらい）、それを吸引してから、溶解液をいれ全体になじませています。その後の実験に支障がなければ核酸を分解させ粘度をさげるためるbenzonase nucleaseを1/10000~1/1000ほど加えた溶解液を使います。 MS解析などでは、分解・タンパク修飾（の除去）などを極力防ぐため、10%TCAを使うそうです（web でprotocolが公開されています）。 溶解後、自作のシリコンゴムスクレーパー(1000uLチップを逆向きで使うこともあり）で集めチップ等で回収したり、benzonaseを使用したときは傾けておけば下方に溜まるのでそのままチップで吸い込み回収します。 再現性ある結果を期待するするなら、可能な限り、ice-coldに保つことをお薦めします。 また各種inhibitor（タンパク分解酵素阻害や脱リン酸化酵素阻害など）やApyraseのlysis液への添加も検討すべきです。

(無題) 削除/引用 No.2583-7 - 2013/11/24 (日) 01:28:09 - 名無し ネットに出回っている情報を総合すると細胞１個あたりの総蛋白質量はせいぜい1~5 ngくらいらしい。で2583-1は5000000個の細胞を500μlのlysis bufferで溶かしたわけだが、だと計算上は数mg/mlくらいの濃度にはなるわけだが。で、これはあくまで、大部分の蛋白質が可溶化出来たことが前提であって、DNAとかと違い蛋白質の性質はそれぞれ大きく異なることがしばしばあるので、個々の蛋白質が可溶化できるかどうかは、これは使用したlysis bufferの組成に大きく依存する。なんで、使用したlysis bufferの組成がわからないのであれなんだが、そのlysis bufferで可溶化出来る蛋白質がそれならばそういうことなのかもしれない。大事なことは、自分の目指す蛋白質が可溶化できている、あるいは実験目的にかなうならばそれでいいと思うし、そうでないならlysis bufferの組成を変えて検討する必要がある。一般的には1~2%SDSを含むbufferや8M尿素など強力な変性剤を含むbufferはより多種類の多様な蛋白質を可溶化できるので、回収できる蛋白質量もかなり増すけど、逆に実験目的にあまり関係ないていうかいらない蛋白質もとれてくるし、DNAとかも混ざってネバネバするからこれは剪断処理しないといけないとかもある。非イオン性界面活性剤のbufferは可溶化出来る蛋白質の種類はある程度制限されるけど(たとえば細胞内蛋白質の大きな割合を占めるクロマチンとか核関係の蛋白質は可溶化しにくい）、必要な蛋白質が可溶化されていれば、関係ない蛋白質の混入は減らせるのでいいともいえる。 やっぱ、目の前で何が起きてるのか想像しながら、自分の実験目的に応じて自分自身で条件を至適化（もちろん100パー完璧は無理だけど、そこにできるだけ近づけるようなプロセスは）はやっぱ必要とおもう。 あとlysis bufferの組成（界面活性剤の種類とか還元剤の有無とかそっち関係で）と個々の蛋白質濃度定量法には合う合わないがあるからそれも注意したほうがいいていうか、そういうのは説明書に書いてあると思うからチェックしたほうがいい。たとえばブラッドフォールドは濃いSDSとまざるとバーって青くなるし、BCA法はSDSはOKだけど還元剤があると測れない。280nmはトライトン関係が蛋白質と吸収被るわな。

(無題) 削除/引用 No.2583-6 - 2013/11/23 (土) 20:21:04 - qq ＞接着培養細胞500万個くらいの10mm dishにPBS2回リンスして、 これは、10cm-dishですね。 １）www.piercenet.com/instructions/2160805.pdf　のマニュアルを読みましたか？そこではスクレーパーでかき取らないで、dishに直接M-PERを入れています。私もその方が良いと思います。 １）M-PERのマニュアルでは、BradfordやBCAでタンパク定量してますね。 ２）初心者の方が組成の確定できない抽出キットに頼るとは、度胸がありますね。嫌味な奴だな、とおもうかもしれません。まあ、その通りです。「自分で作った抽出液と同等品だからm-perを使えば良いな」とは思いますが、調子が悪ければ、自分で作れば良いのです。 でもまあ普通、bicineを緩衝液の第一選択にはしませんね。bicine（pI8.3）であれば、問題が特になければtrisですよね。値段の問題かなあ？それとも両極性な構造が重要なadvantageになるのかなあ。その辺のことで、やっぱりm-perがいいよなあ、というかたがいれば、お教えいただきたいです。（あれれ、質問になちゃった。）

(無題) 削除/引用 No.2583-4 - 2013/11/23 (土) 15:30:18 - ~ やる気も大事ですが、キットを使うのであればマニュアルを読むことも大事です。 ・書き漏れでなければ、m-perをいれた後の操作が推奨プロトコルと違う ・推奨たんぱく質量測定法以外で測ろうとしている ・回収たんぱく質量が少ない場合のメーカー推奨のトラブルシューティングを行ったと書かれていない ・"ずっと保管"の保管条件と用途が書かれていない のあたりを確認して見ては？

(無題) 削除/引用 No.2583-3 - 2013/11/23 (土) 13:21:16 - おお m-perの中になにかUV領域でつよい吸収があるものがはいっていると、m-perがはいったものをブランクにとると、振り切れた状態を0にして測っているようなものなので うまくはかれないとおもいます。その試薬自体がUVではかれるものなのか確認した方がいいかとおもいます。 すでに指摘があるように。cell lysateのばあいUVは蛋白定量には向いてないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2583-2 - 2013/11/23 (土) 13:11:49 - 独り言 吸光度測定はちゃんと行えているのでしょうか？特にこの場合はブランクを水にしてないですよね。そのm-perとかいう試薬をブランクにしてから、細胞を溶かした溶液を測定してますでしょうか。 どちらにしても280nmでタンパク質濃度を測定するのは良くないです。mRNAなども多量に含まれているはずなので、正確ではありません。ただそれでも0.2mg/mlは少ない様な気がします。細胞はなんですか。 タンパク質濃度測定はBCAなりブラッドフォードなり使用しましょう。

接着細胞からの蛋白抽出について 削除/引用 No.2583-1 - 2013/11/23 (土) 10:12:42 - kkoommuu タンパク質 抽出について困っています ほんとに初心者ですが、やる気をだいして頑張っています。 基本的な質問ですみません。。 接着培養細胞500万個くらいの10mm dishにPBS2回リンスして、スクレーパーで細胞をはがして5ml位のPBSでこれを回収、10mlコニカルチューブに移して 1500rpm５、5分遠心 上清捨てて、これにm-perという製品抽出バッファー500ulいれて、5分静置 その500ulを2mlのチューブに移して10000rpm 5分遠心して上清を蛋白抽出物として回収しましたが、 吸光度計でA280より濃度測定すると、0.2mg/ml程度しか表示されません。 なにか行程が間違っているのでしょうか。 あと、最終の500ul抽出物にはそのm-per試薬に溶けているので、そのままずっと保管しておいていいのでしょうか。。 最近研究をはじめたばかりで困っています。よろしくお願いいたします。

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