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(無題) 削除/引用 No.2541-5 - 2013/11/13 (水) 10:10:21 - プルダウンアッセイ 独り言さま 誠にわかりやすい、親切な返信をありがとうございます。 大腸菌から大量に合成できるタンパク質でなく、ある細菌で合成させて作製するタンパク質です。 私の所属している研究室では、ある細菌で合成させたHisタグ付与タンパク質の精製を、Niカラムで行っています。そのため、今回は、目的タンパク質にHisタグならびにFlagタグを付与して、ある細菌で合成させた後、Niカラムで精製する予定でおりました。 しかし、独り言さまのアドバイス（Flagビーズはあくまで抗体のため高価な事やHisではノンスペの多い事）より、今回は、目的タンパク質にHisタグならびにGSTタグを付与するのがよいのかなと考えております。 Promegaには、HaloTag® Mammalian Pull-Down SystemsやMagneGST™ Pull-Down Systemがあり、使用したいのですが、タンパクを作る際に必要となるVectorが決まっており、今回の場合ではある細菌内でそのVectorが機能するかわからないため、使用できないと考えております。 長文になり申し訳ございません。 タグ付きタンパク精製からのスタートになります。

(無題) 削除/引用 No.2541-4 - 2013/11/12 (火) 20:03:51 - 独り言 FLAGで免疫沈降するならSigmaのFLAG M2 agaroseが一番人気です。 ただ、大腸菌で合成したタンパク質をFLAG M2 agaroseで行うのは割高です。なんせこれは抗体ですから。 大腸菌から大量に合成したタンパク質であれば、GSTをGlutathione sepharoseでやるか、HisをNi-NTAでプルダウンするのが一般的です。これらは抗体ではないので、高価ではないですし、簡単にビーズから溶出することもできるので、精製も安価にできます。FLAGに比べて。 ちなみにGSTのデメリットはGFPなみに大きいが、HIsよりノンスペは少なくてよい。 Hisのデメリットはノンスペが多いです。だってただのヒスチジンが６個ですからね。

(無題) 削除/引用 No.2541-3 - 2013/11/12 (火) 19:30:03 - プルダウンアッセイ 独り言さま 返信ありがとうございます。 理解する必要があると思い、いろいろ参考書等を読んでいますが、Glutathione-Sepharoseビーズを使用するのは大きな間違えでした。 実験医学ではアマシャムのGlutathione-Sepharose4Bを使用した例が載っていますが、Flagのビーズでお勧めのものなどはありますでしょうか。 度々の漠然とした質問で、申し訳ございません。。。

(無題) 削除/引用 No.2541-2 - 2013/11/12 (火) 18:55:22 - 独り言 > HisならびにFlagタグ付きのタンパク質（A：ベイト）に細胞抽出液をインキュベートし、ベイトに結合するタンパク質を検出したいと考えております。 > > 遂行にあたり、HisならびにFlagタグ付きのタンパク質（A：ベイト）は作製予定でおります。 > 作製後、プルダウンアッセイを行う際、実験医学（タンパク質実験ハンドブック等）の方法を参考にしながら、Glutathione-Sepharoseビーズなどを用いて、できるものなのでしょうか。 > その参考書というか原理をちゃんと理解してから実験した方が言いとは思いますが、もちろんGSTをベイトにくっつけていればGlutathione ビーズでプルダウンできます。文章からするとHisかFLAGのようですが。それならHisかFLAGのビーズでプルダウンしてもいいとは思いますが。

初めてのプルダウンアッセイ 削除/引用 No.2541-1 - 2013/11/12 (火) 18:03:59 - プルダウンアッセイ お世話になっております。 タンパク質相互作用を調べるため、プルダウンアッセイを行うことを考えております。 HisならびにFlagタグ付きのタンパク質（A：ベイト）に細胞抽出液をインキュベートし、ベイトに結合するタンパク質を検出したいと考えております。 遂行にあたり、HisならびにFlagタグ付きのタンパク質（A：ベイト）は作製予定でおります。 作製後、プルダウンアッセイを行う際、実験医学（タンパク質実験ハンドブック等）の方法を参考にしながら、Glutathione-Sepharoseビーズなどを用いて、できるものなのでしょうか。 漠然としたした質問で申し訳ございません。。 アドバイスいただけましたら、幸いです。 宜しくお願い致します。

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