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(無題) 削除/引用 No.2536-11 - 2013/11/13 (水) 00:13:05 - おお わたしも不明瞭なところがおおくちょっとどうアドバイスしたらいいのかと、、、放線菌のベクターであっても大腸菌で増えるシャトルベクターになっているのが大概だと思いますがどうでしょうか。そう言う意味ではクローニング 技術が確立した大腸菌を使ってまず目的のインサートなどが入ったベクターを作るのが普通のように思ってます(その分野では普通でないとかいうなら話はべつですけど)。 なのでまずは大腸菌にいれてプラスミドをつくってそれを放線菌にいれるという作業がいいようなきがします。放線菌もプラスミドのメチレーションにたいしてアタックするものと、ひかくてき アタックしないものがあるようなので、まずアタックしない株に入れてプラスミドの大腸菌による修飾を解除する方法があるようですので、もしかしたら、放線菌からプラスミドを回収するひつようはあるのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.2536-10 - 2013/11/12 (火) 23:17:36 - 中年 あいまいな記述が多くて的確な回答が難しいのでは？ プラスミド構築の宿主はもちろん大腸菌ですよね？放線菌用のプラスミド回収法なるものがどういうものなのか、説明していただくことが必要でしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2536-9 - 2013/11/12 (火) 10:36:54 - AP ああ、あと >サンプルは回収後、RNase Aで再度処理をしています。 もしこの時点でRNAがキャリーオーバーされるような精製法なら、吸光度はあてになりません。分解してもヌクレオチドに吸光性がありますから。

(無題) 削除/引用 No.2536-8 - 2013/11/12 (火) 09:34:21 - ~ まずは、問題ない部分と不確定部分の洗い出しをしてはいかがでしょうか。 いろいろな方法で調べたというのはどのような方法で調べて、その方法によりどこに問題が無いことが確認されたのですか？ コンピタントセルと空ベクターは、ラボ内で使われた実績があるものなのでしょうか？ 空ベクターでのトランスフォーメーションや、コンピタントセルをそのままプレートに撒く等のコントロールで何か取っているものはあるのでしょうか？ 先輩は、放線菌を用いたプラスミドワークに精通した方なのでしょうか？ ミニプレップの開始前後のどちらに問題があるかを調べるのであれば、いきなり放線菌懸濁液をフェノクロで振ってイソプロ沈で回収するのも有効だと思います。 回収率は悪いですが、ゲノムDNAとプラスミドの両方が回収されますので、最悪、ゲノムDNAよりもプラスミドの方が量が少ないことが確認できます。 ラボで既に使用されているプラスミドがあれば、それでトランスフォーメーション→ミニプレップすることで、腕や試薬の問題ではないことが確認できるでしょう。 既に使われたことのあるインサートを再度ご自分の手で入れ直してトランスフォーメーション→ミニプレップすることで、インサート以外のすべての手順に問題が無いことが確認できるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2536-7 - 2013/11/12 (火) 09:01:24 - 波平 ベクターがどういうものか分からないので何ともいえないのですが。 ベクターがブロードレンジもしくは大腸菌のoriを持っているなら， 回収したものを大腸菌に入れることはできないのでしょうか。 見えなくてもケミカル法でもエレポで回収できそうですが。

(無題) 削除/引用 No.2536-6 - 2013/11/12 (火) 08:55:42 - 断片化？ まずは、プラスミドの構築方法を疑うよりも、同じ方法で何も入っていないベクターを精製できるか確認しましたか？ もし、インサートをいれていない（ライゲーションしていない）ベクターでも精製できないのであれば、精製の過程の問題ですよね。 精製にカラムを用いていないのであれば、断片化したヌクレオチドが出てしまうのかもしれませんし、短いオリゴであれば0.8%だと流れてしまうか、薄くて見えづらいでしょうし。 アルカリの濃度が濃いと、プラスミドであれ断片化しやすくなる気もしますが、その辺はいかがでしょう？

(無題) 削除/引用 No.2536-5 - 2013/11/12 (火) 08:17:46 - Harmonia >薬剤耐性コロニーが約40個程得られ、液体培地に植菌、プラスミド回収を >放線菌用の方法を用いて（キット法よりもアルカリ濃度が高く、リゾチー >ム処理が30分）行いました。 宿主は放線菌なのですね？ >コンピテントセルを作り直し、 コンピテントセルそのものは、薬剤耐性を持っていないことを確認していますか？ その宿主とベクターの組み合わせで、期待できるコピー数のプラスミドが 取れないことがお悩みでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2536-4 - 2013/11/12 (火) 02:26:51 - 独り言 > 250-300 nm吸収スペクトラムは確認出来るのにも関わらず（純度約1.9、400 ng/μl程）0.8%アガロース電気泳動を行うとバンドが全く確認出来ないという結果になりました ここだけ読んだら、プラスミドが分解されてしまったように思えます。泳動してもスメアもみえないのでしょうか？ラベルのミスとかで、DNAse freeのRNAseではなくて、RNAse freeのDNAseを間違って加えていたりして。

(無題) 削除/引用 No.2536-3 - 2013/11/11 (月) 21:43:02 - おお まあよくわからないところがあるのですが、まずは普通にminiprepして、インサートが確認されたものについて、transformationし直して放線菌用のpreparationするとか、さらに精製してつかうとかしたほうがいいのではないでしょうか。まだ大腸菌が保存されていれば、増やし直せば確認はできますし。 その放線菌用のpreparationは、実際にあなたの手ではワークしているんでしょうか?ワークしていればconstruction作業に問題があるとしぼれますが、、、 拾った菌がネガティブならどっかからこんたみしてるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2536-2 - 2013/11/11 (月) 18:43:46 - AP >250-300 nm吸収スペクトラムは確認出来るのにも関わらず DNAが取れてなくても、夾雑物や溶媒の組成でそれなりの吸光度はでる場合があるからなあ。放線菌用の精製法といっても、フェノール抽出したのか、カラムなどを使ったのか（そうであればどのブランドか）、肝心なところがわからない。 >0.8%アガロース電気泳動を行うとバンドが全く確認出来ないという結果になりました。 これは精製物をそのまま泳動したんでしょうか（intact plasmid）。でも、それにしちゃ脚注に制限酵素処理のことが書いてあって、、、、、？ もしやっていないなら、制限酵素処理していない精製直後のプラスミドを泳動してみたらどうなるでしょう？　 DNaseが取り除けていたいがために、制限酵素処理のインキュベートの間にプラスミドがすっかり分解してしまうということが、ないわけではないので。

構築プラスミドが回収出来ない謎 削除/引用 No.2536-1 - 2013/11/11 (月) 18:13:00 - シュウ こんにちは。初めてフォーラムを使わせていただきます。 過去のトピックをざっと見てみましたが、同じような状況の方がいなかったので、今回書き込みをさせていただきました。 構築したプラスミドが回収出来なくて、とても困っています。 まず最初に、Gene-Artを用いて放線菌発現用のベクター（約8.4 kbpチオストレプトン耐性）にインサートを組み、薬剤選抜を行いました。 薬剤耐性コロニーが約40個程得られ、液体培地に植菌、プラスミド回収を放線菌用の方法を用いて（キット法よりもアルカリ濃度が高く、リゾチーム処理が30分）行いました。 250-300 nm吸収スペクトラムは確認出来るのにも関わらず（純度約1.9、400 ng/μl程）0.8%アガロース電気泳動を行うとバンドが全く確認出来ないという結果になりました。コンピテントセルを作り直し、何度構築からやり直しても同じ結果だったので、構築方法をIn-futionに変更して試してみましたが同じような状況になってしまいました。 色々な方法で調べてみたり、先輩に聞いたりてみましたが、解決の糸口が全く掴めません。構築が出来ないと、次のステップに進めないので大変困っています。 皆さん、知恵をかして頂けないでしょうか。 ※ ・サンプルは回収後、RNase Aで再度処理をしています。 ・インサートはGC含量の66%の約1.6 kbpです。 ・制限酵素処理サイトはHind�V、Xba�Tで12塩基間隔を開けています。 ・制限酵素処理時間は3時間です。

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