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Re: 削除/引用 No.2532-6 - 2013/11/09 (土) 23:23:51 - UC マーカーはちゃんと見えているということだから、泳動条件が 悪いとかではなさそう。GAPDですら確認出来ていないということ なので、そのプライマーセット（と目的のセットも）を用いて 普通のPCR機器で増幅したものをポジコンとして一緒に流せば 少なくとも、同じサイズでバンドが確認できるでしょう。これすら 見えなければ、泳動条件の他にtemplateなどを疑う必要がありますが。 アンプリコンのサイズは既知なんですよね。TaqManは短いものだと60bp とかなので、例えば、1%のアガロースゲルだったりするとぼやけて見え ないかも。2-3%のゲルですか？

(無題) 削除/引用 No.2532-5 - 2013/11/09 (土) 22:03:56 - ~ http://www.bio-rad.com/japan/pdf/lsg/news_info/2002SEP.pdf だと見れてますね。 とりあえず電気泳動の問題を否定するには、簡易精製してから流すか、流さずに吸光度を見てみる？それでバッファーによる電気泳動の不具合は否定できるかと。

(無題) 削除/引用 No.2532-4 - 2013/11/09 (土) 20:23:42 - あ マーカーは流しています。 そちらはきれいにbandが見えているのでエチブロは悪くないと思います。 コントロールのGAPDHすら見えないのが問題です。

(無題) 削除/引用 No.2532-3 - 2013/11/09 (土) 20:09:25 - ふみ 100bpラダーの類は一緒に流しましたか？ EtBrが10分で十分とは限らないと思います。 使い続けている内に染まりが悪くなるということはあります。

(無題) 削除/引用 No.2532-2 - 2013/11/09 (土) 15:00:28 - qq Taqman-probeで定量するときに得られる増幅曲線は、添加したTaqman-probeがどれだけ分解したかを見てるのですよねえ？（自信ありません） そうだとすると、Taqmann-probeをケチると、そこまでしか検出できないとの理解でよいでしょうか？ Sybrgreenで定量するときは出来たDNAを定量しているのだから、そのとき頭打ちになるのは、内在性のdNTPやPCRプライマーを使い切ったところまでPCRされているでしょうが、Taqman の時は、違うんじゃない？

realtimePCR後のPCR産物の電気泳動 削除/引用 No.2532-1 - 2013/11/09 (土) 12:59:57 - あ Tagman probeを用いてApplied Biosystem機器でrealtimePCRを施行。 sigmoid曲線を確認し（Ct値として25-30），PCR産物をアガロースゲル電気泳動で泳動しエチブロ染色をしましたが，bandが見えてきません。 （conrolとしてのGAPDHも見えません） これまでrealtime後の産物を泳動確認したことがなったのですが，新人のPCR・realtimeの練習として行いました。 realtimeできれいなsigmoidを確認できるのに，PCR産物の電気泳動で発現が見えない原因なにかあるでしょうか？ PCRがかかっていないことはないと思いますし， (realtimeの結果がダメとなるとRNA・cDNA・realtimeまで見なおさなければなりません…) とすると電気泳動条件でしょうか？ しかしPCRがかかっており，PCR産物がそれなりに量がある(realtime　Ct値25-30)のであれば，サイズ確認は別としてもエチブロに少し反応させればUVで確認できると考えますが，いかがでしょうか？ エチブロの反応は10分程度で十分ですよね？ ご意見お願いします

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