>[Re:7] ~さんは書きました :
> 何が問題なのかといえば、どこに問題があるかを切り分ける実験をしていない点だと思います。
>
>
> 前にできていたというのは、ラボ内の別人ではなくご本人でしょうか。
> そうであれば、腕の問題ではないでしょうから、
> １．J774の取り違えまたは変質
> ２．Plat-Aの取り違えまたは変質
> ３．pMX-GFPと他のGFP発現ベクターの取り違え
> あたりをつぶしていくのが早いかと。
>
> 前にうまくいっていたときは、ウイルス液を冷凍保存していなかったのでしょうか？
> それがあれば、１の可能性はつぶせますよね。
凍結保存したウイルス液では、タイターは非常に弱かったのですが、細胞がGFPで光っていることが確認できましたので、取り違えではないと思います。
> 逆に、ご自身で作られたウイルス液を、他の方の細胞にかけてもらってみてはいかがでしょうか。
NIH３T3という細胞にかけてみたのですが、GFPで光っているようなのでウイルス液自体は正常であるように思います。
> それと、ウイルスベクターは前と同じチューブの物を使っていますか？増やしなおしていませんか？
同じチューブのものを使っており、増やしなおしてはいません。
実験をやり直していて思ったのですが、ウイルスをかけている時間が長いのではと思ってきました。うまくいっていたときは12時間くらいでメディウムチェンジしていたのですが、ここ最近は15時間くらいかけていて、その時点で蛍光顕微鏡でみると、細胞の破片のようなものが光っているのがところどころに散見されたり、細胞膜周辺がかなり光っていたり、死細胞がかなり光って見えます。しかし、メディウムチェンジした後もう一度観察するとそういったものは洗い流されてしまうのか見えなくなり、真っ暗になります。
>[Re:6] 独り言さんは書きました :
> パッケージング細胞にちゃんとウイルス作成の遺伝子が維持されているのであれば、GFPの発現がウイルスのタイターと相関しますが、パッケージング細胞のウイルス遺伝子が脱落してしまっていたら、GFPは発現しますが、ウイルスはできません。ちゃんとパッケージング細胞は薬剤でセレクションして培養してますでしょうか。もしくは無駄に長くケイダイをしない方がいいです。
>
>[Re:5] Harmoniaさんは書きました :
> > 素朴な疑問なのですが、「パッケージング細胞がGFPで光っている」＝
> > 「ウイルスができている」ととらえてよいものなのでしょうか？GFPタ
> > ンパクは効率よく産生されているが、ウイルス形成に必要なタンパク質
> > はあまり効率よくつくられていないという可能性はあるのでしょうか？
>
> 危うさを感じます。
> 細胞にプラスミドを振りかけて、なぜウイルス粒子が作られるのか、分かっ
> ておられないと感じました。
パッケージング細胞にコードされているpol,gag,env遺伝子のプロモーターよりも、プラスミド上のGFP遺伝子のプロモーターの方が強力である場合や、独り言さんの仰るようにパッケージング細胞側のプロモーターが壊れてしまっているような場合だと、GFPのみ産生され、それを包み込むウイルス粒子は産生されないこともあるのではないでしょうか？ |
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