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(無題) 削除/引用 No.2516-13 - 2013/11/05 (火) 23:28:21 - 実験はじめました 皆様ありがとうございました。 皆様のご意見を参考に一個ずつ検討していきます。 まずは遠心分離しないで、濃いめに分注してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2516-12 - 2013/11/05 (火) 21:59:19 - 名無し やっぱ、論文とかでその細胞使ってる人探して、『うちの細胞何か増えにくいんだけど、どうよ』てメールして聞くのが確実で早いと思う。外国だと英語で書かないと分かんないけど、もし自信なければ、そのときは先生に頼んで書いてもらえばいい。 あと、理研とかのセルバンクから購入したものなら、聞けば相談に乗ってくれると思う。

(無題) 削除/引用 No.2516-11 - 2013/11/05 (火) 13:16:13 - na na shi マイコプラズマ感染は否定できますか？ PCR検出キットが売っていますので、試してみてはいかがでしょうか。

問題は起きているの？ 削除/引用 No.2516-10 - 2013/11/05 (火) 10:37:30 - ~ そもそも、doubling timeが7日のchordomaもありますし、plating efficiencyがひくいものもありますが、どの部分を問題と考えているのでしょうか？ 1週間ごとに継代はできているのですよね？その期間が提供元と比べて長いのですか？ それとも、細胞が死んでいくというのが、提供元と比べて低いのでしょうか？ どのような問題が起きていて、どうなれば解決すると判断されるかを明確にすることで、 取った対応が問題を解決したのかを判断できるようになるでしょう。 >MediumはDMEM＋10％FBS＋１％ABTです >まずトリプシンーEDTAにて細胞をはがし、遠心分離し、上澄みを吸いその後Mediumを入れてまぜ分注しています。 お使いの細胞株でこれらの操作が妥当であることはどのように確認されましたか？ 違う培地で飼われているchordomaはあります。 chordomaを使用していて、違うタイミングで培地交換をしている人はいます。 トリプシン-EDTAの濃度や処理時間変えるとうまく増えるようになる細胞株もあります。 遠心に弱い細胞株もあります。 ピペッティングに弱い細胞株もあります。 ご自身で細胞株を樹立しようとしているのでない限り、培養できる人に教わるのが早く培養できるようになるポイントです。

(無題) 削除/引用 No.2516-9 - 2013/11/05 (火) 06:33:49 - おお どなたか書いていますが、ねんのため。 血清のロットで相性が極端に悪いと、最初は大丈夫っぽくても徐々に調子が悪くなってきたりします。もちろんいきなり調子が悪いというのもありえますけど。

(無題) 削除/引用 No.2516-8 - 2013/11/04 (月) 20:59:43 - Harmonia おおさんもおっしゃる通り、もらったところに聞くのが良いと思います。 そもそもそういう性質の細胞かもしれないし。

(無題) 削除/引用 No.2516-7 - 2013/11/02 (土) 14:50:29 - おお >[Re:1] 実験はじめました！さんは書きました : > 今使っている脊索腫の細胞株はとても発育が遅く1週間でPassageできたらいい方です。 そう言う細胞についてくわしくないのですが、その細胞の培地や培養方法はお調べの上やっているおもわれますが、購入できるような細胞株であれば、WEB上などでいいですから、カタログやproduct sheetのようなものを一度確認してみてもいいかもしれません。もしそう言うところから手に入らない細胞なら、もらったところとかがノウハウを持っていると思われますので相談するのも手かと思います。 > まずトリプシンーEDTAにて細胞をはがし、遠心分離し、上澄みを吸いその後Mediumを入れてまぜ分注しています。 遠心はやるひともいますが、せずに血清入りの培地で希釈してけいだいしてしまうひともいます。前々からえんしんして回収されてけいだいされてきた細胞ならまあそれが問題ということはないとおもいます。そう言う場合でも念のため弱い遠心力で回収してみるのはてかとおもいます。500gもあればおちてきますし。 トリプシンはよりマイルドなTrypLEに変えてみるのも手かもしれません。あと細胞培養の経験がないようでしたら、トリプシン処理後培地をいれたご、極微量とって、トレパンブルー染色などで、細胞のviabilityを確認しておいた方がいいかとおもいます。悪くても95%以上はないと、けいだい後何らかの影響がでるとおもいます(弱い細胞は死ぬか増えなくなるか、そうでもない細胞でも形態がよくないとか、一時ふえがわるくなるとか)。 > 2日後見ると細胞はいるのですが細胞が壊れたような極小片が散らばっていてMediumを交換してもとれずその後細胞が死んでいってしまいます。 けいだいで負担がかかりすぎると細胞が接着後でも調子が悪くなりapoptosisなどを起こすことがありますそうすると、apoptotic bodiesが培養液にういてくるということもあります。そう言う場合は接着して増えようとしている細胞も調子が本調子でないこともあるので、ふえがわるくなったりするのはありえますが、浮いたものがあるばあいいつもそうなのかというとそうでもありません。浮きやすくて浮いても増える細胞もありますし、ある程度増殖中に死ぬような細胞もあるかもしれません。 > > 育ちにくい細胞を育てている方がいましたら注意するポイントを教えてください。 ねんのためマイコプラズマもうたがってみてください。

(無題) 削除/引用 No.2516-6 - 2013/11/02 (土) 14:08:30 - mon 直輝さんも述べていますが、私もtripsin処理後は遠心していません。 具体的には、細胞をD-PBS(+EDTA)でリンスし、10cm dishの場合TriPLE Express溶液を3~4滴垂らし全体になじませ、37℃で保温。細胞が剥がれてきたら、培地5mlで回収し新しいdishにまき直しています。 培地やPBSを吸い取るときの注意としては、アスピレーターで一通り吸引した後、細胞が乾燥しないようにアスピレーターの先端をdishから外しdishを傾けておくと、残存液(0.5mLほど）が溜まりますので再度素速く吸い取ります（直ぐに次の操作を行わない場合は乾燥するので蓋をするのを忘れずに）。このようにすれば、洗いの効果が高まります。 trypsin-EDTAで剥がれづらい場合は、Accutase ( or AccMAX)を使用すると細胞のダメージが少ないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2516-4 - 2013/11/02 (土) 13:07:46 - 直輝 その細胞は使ったことがないので一般的な意見ですが ・トリプシンEDTAの後、遠心分離は必要ないと思う →トリプシンEDTAを入れて、すぐに吸って、１分ほど待って培地を入れて細胞をはがして分注すればよいと思う。 ・細胞が壊れたような極小片が散らばっていて →そういうのは普通あるものだし気にすることはない。悪影響もないから取り除く必要もない。 ・何倍にPassageしてるのですか？そんなに増殖が遅いのなら、せいぜい２倍かなと思いましたが。細胞を薄くまきすぎると余計に育ちません。

(無題) 削除/引用 No.2516-3 - 2013/11/02 (土) 08:16:38 - mon 脊索腫の細胞株は使ったことはありませんので、参考程度に... (1)FBSのロットが合っていないとどうしようもないことがあるので、もし細胞バンクから購入した場合は指定のFBSを購入しある程度増やしてstockしてから、ラボのFBSでの増殖を調べてみることもします。 (2)低温に弱い細胞がありますので、トリプシンーEDTAも温めておいて出来るだけ短時間で回収した方が良いときがあります。 (3)遠心（物理的衝撃）に弱い細胞が希にあります。15mlチューブを卓上のswingローターで回すなら800rpm x 3~5分ほどで緩く沈殿させてください。 (3)増殖が遅い細胞は、２〜３倍に希釈・培養しましょう。凍結から起こした直後などは、指定されていなくてもコラーゲンコートdishを使うと生存率が上がる時があります。 (4)conditioned medium（培養上清）を1/5-1/3ほど混ぜるとか。

(無題) 削除/引用 No.2516-2 - 2013/11/02 (土) 03:54:37 - Hajime Molecular Characterization of Putative Chordoma Cell Lines http://www.hindawi.com/journals/sarcoma/2010/630129/ のTable１にCell lineとGrowth Mediumが記載されていました。 実験はじめました！様が御使いのChordoma cell lineは分かりませんが、参考までに。

細胞がうまく育ちません！！！ 削除/引用 No.2516-1 - 2013/11/02 (土) 03:43:33 - 実験はじめました！ 最近遺伝子の実験を始めたばかりの初心者です。 現在脊索腫の細胞株を育てているのですが、全然Passageできません。 MediumはDMEM＋10％FBS＋１％ABTです。 今使っている脊索腫の細胞株はとても発育が遅く1週間でPassageできたらいい方です。 まずトリプシンーEDTAにて細胞をはがし、遠心分離し、上澄みを吸いその後Mediumを入れてまぜ分注しています。 2日後見ると細胞はいるのですが細胞が壊れたような極小片が散らばっていてMediumを交換してもとれずその後細胞が死んでいってしまいます。 育ちにくい細胞を育てている方がいましたら注意するポイントを教えてください。 初心者のため表現がうまく伝わらないかもしれませんがよろしくお願いします。

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