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(無題) 削除/引用 No.2500-8 - 2013/10/31 (木) 03:27:15 - tuf みなさん親切なご回答ありがとうございました。 >[Re:6] adeさんは書きました : > pGL2-Basicでしょうか？ まさにpGL-Basicです。これに2.3kbほどの目的遺伝子が組み込まれています。 > また、polyAまで含んだ状態で組換える事もできるので、その場合はBamHI、SalIを選べばよいと思います。 > 今後使用するベクターの確認をしたところ、現段階でpolyAもまとめて切り出す必要があるようです。母国語が日本語ではない方に確認したため詳細な理由はおぼろげにしかわかりませんが…。いずれにしろご指摘いただけたことで判明しました。ありがとうございます。 結局目的遺伝子の方にMCSにない制限酵素(NcoI)の配列をくっつけて、luc側はSalIで切るような形になりました。 解決しましたのでご回答いただいたみなさまには再度お礼申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2500-7 - 2013/10/29 (火) 18:49:11 - AA 質問文から察するに、既に全配列のデータをお持ちということでしょうか？ それであればとにかく目的の配列が切り出せる酵素で切ってしまうのが良いかと思います。 Klenow polで平滑化して、平滑断片同士のライゲーションで入れてしまう手もあります。 EcoRVか何かで切ったMCSのあるベクターに戻せばその後の載せ替えも楽かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2500-6 - 2013/10/29 (火) 12:58:24 - ade pGL2-Basicでしょうか？ パンフレットに載っている制限酵素は全部ではないので、探せば使えそうなものは見つかります。 Web上でも制限酵素サイトの一覧を出せるサイトがあるので、そういうのを利用してみるとよいと思います。 目的の遺伝子が切断されなければ、ベクター内が切断されても問題はないので、1箇所切断にこだわる必要もありません。 また、polyAまで含んだ状態で組換える事もできるので、その場合はBamHI、SalIを選べばよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2500-4 - 2013/10/29 (火) 08:28:49 - おお ポピュラーな方法です。ただ制限酵素の選び方などちょっとしたTIPはありますので、、、誰かに相談した方がよさそうですが、、、

(無題) 削除/引用 No.2500-3 - 2013/10/29 (火) 06:22:14 - 独り言 みなさんやっとります。 とりあえず、生協なり本屋さんの生物系のコーナーに行き、 https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/book/9784897069272/index.html 改訂第３版 遺伝子工学実験ノート 上 の202ページを読んでみましょう。 気に入ったら、買って、勉強すればよろし。

(無題) 削除/引用 No.2500-2 - 2013/10/29 (火) 06:05:17 - モモ クローニングの１０１ですね・・・ 答えは、できる、ですが、指導者と戦略を相談したほうが良いでしょう。

ベクターから制限酵素サイト以外のサイトで切り出す方法について 削除/引用 No.2500-1 - 2013/10/29 (火) 04:22:49 - tuf はじめまして。 私は現在、訳があって専門ではないのですがアデノウィルスの作製をしています。 他の研究室から貰った、すでに目的遺伝子の組み込まれたベクターから「目的遺伝子＋Luciferase gene(luc)」までをまとめて切り出し、アデノ作成用のベクターに組み込みたいと考えています。 ベクターマップでは、目的遺伝子が制限酵素サイト(3-47)に組み込まれており、制限酵素サイトのすぐ後にlucが76〜1728の位置に存在しています。 ベクターを販売している会社のサイトに、制限酵素サイト以外でベクターを切ることのできる制限酵素のリストがあるので、そこからlucの終わりあたりにある配列がないか調べたところ、1693の位置にEcoNIで切れるサイトがありました。しかし目的遺伝子が切れてしまうため使用することができません。 以上が前提でお聞きしたいのが「目的遺伝子＋luc」を切り出すために、貰ったベクターを鋳型としてluc側から読み取るプライマーに都合のいい制限酵素で切れる配列を足したものを設計することは可能なのでしょうか。 また他に「目的遺伝子＋luc」を切り出すための良い方法はないでしょうか。 ここまで長々と読んでいただきありがとうございます。よろしくお願いします。

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