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(無題) 削除/引用 No.2482-11 - 2013/10/25 (金) 08:41:56 - -- >[Re:10] TK-1さんは書きました : > あと、scrambleってコントロールになるんですかね？ある遺伝子の発現や細胞生物学的活性がRNAi pathway依存的な場合、ターゲット遺伝子は阻害しないけどRISCにロードされるようなヘアピンを大量に発現すれば影響は出るような気がする。本当は(off targetはないと仮定して）キッチリとRISCにロードされるけどターゲットがないluciferaseなどのshRNAをコントロールにすべき。Luciferaseのヘアピンを入れても見ている遺伝子が半分くらいまで下がったりして。。。。その辺はキッチリと考えた方がいいですよ。 scrambleでもluciferaseでも、off targetがないと仮定するなら一緒じゃないかな。 一応、scrambleもblastで調べてターゲットがないように設計しているはずだし。 コピー数を増やしてshRNAの量を増やすと確かに効果は上がるかもしれないけど、その分ゲノムを壊してランダムに挿入されていくわけですよね？ 他の影響が大きくなることを犠牲にしてそのshRNAを使うよりも、新しく作り直すのに私も一票。 もしくは、episomal vectorで。

(無題) 削除/引用 No.2482-10 - 2013/10/25 (金) 03:56:36 - TK-1 ”scrambleと比べて半分程度まで下がりました、、、、、” それでフェノタイプが出るならよし、出ないなら少々感染効率やコピーナンバーを上げても変わらんような気がする。ヘアピンから作り直しに一票。 あと、scrambleってコントロールになるんですかね？ある遺伝子の発現や細胞生物学的活性がRNAi pathway依存的な場合、ターゲット遺伝子は阻害しないけどRISCにロードされるようなヘアピンを大量に発現すれば影響は出るような気がする。本当は(off targetはないと仮定して）キッチリとRISCにロードされるけどターゲットがないluciferaseなどのshRNAをコントロールにすべき。Luciferaseのヘアピンを入れても見ている遺伝子が半分くらいまで下がったりして。。。。その辺はキッチリと考えた方がいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.2482-9 - 2013/10/24 (木) 22:56:08 - 独り言 >[Re:6] みなさんは書きました : > >[Re:5] 独り言さんは書きました : > > > > 安定発現株だと、同じベクターで２回は効果があまりないかも。 > > さらに多くのshRNA配列が入ると考えると、ノックダウンの効果はより高くなると思ったのですが、違いますか？ > > より多くゲノムに目的遺伝子が挿入されれば、確かに効果あります。一度感染させた細胞にもう一度同じ感染させれば、理想的には２倍になるはずですが、同じ薬剤耐性のものなら、実際には1-2割増程度しか入らないと思います。私の経験的なものなので、タイターなどにもよるとは思います。感染効率が１００％とかならいいのかも。とりあえず、やってみる分にはよいとは思いますが、２倍になるような期待はしないほうがよいです。

(無題) 削除/引用 No.2482-8 - 2013/10/24 (木) 22:44:29 - おお >ノックダウンされたこと以外によるフェノタイプが出てきそうな気がするのですが。。。 これは1回した時点でも懸念は拭えないので、1回目と比べてさらにKDできた場合は、容量依存性を考慮できますし、shRNAレジスタントな発現ベクターでレスきゅうする実験で裏をとるという事もたびたびやられています。

(無題) 削除/引用 No.2482-7 - 2013/10/24 (木) 22:36:58 - おお まあやってみればどうですか。複数回感染というのはまあありえるやり方だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2482-6 - 2013/10/24 (木) 21:05:08 - みな >[Re:5] 独り言さんは書きました : > > 安定発現株だと、同じベクターで２回は効果があまりないかも。 さらに多くのshRNA配列が入ると考えると、ノックダウンの効果はより高くなると思ったのですが、違いますか？

(無題) 削除/引用 No.2482-5 - 2013/10/24 (木) 18:48:34 - 独り言 >[Re:4] みなさんは書きました : > >[Re:2] 独り言さんは書きました : > > なんのウイルスですか。レトロウイルスで安定発現株をとっているのですか。アデノで一過性発現でしょうか。 > > レトロウイルスです。 すいません。タイトル見忘れてました。 安定発現株だと、同じベクターで２回は効果があまりないかも。なくはないとは思いますが。できれば、薬剤耐性遺伝子だけ変えた、同じshRNAのウイルスを使えればよいとは思いますが。でもそこまでするよりかは、もっとタイターが高いウイルスを作れればいいとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2482-4 - 2013/10/24 (木) 17:35:25 - みな >[Re:2] 独り言さんは書きました : > なんのウイルスですか。レトロウイルスで安定発現株をとっているのですか。アデノで一過性発現でしょうか。 レトロウイルスです。

(無題) 削除/引用 No.2482-3 - 2013/10/24 (木) 17:29:09 - 7744 以前同僚が、bone marrow-derived DCでレトロを使って過剰発現する時に、２〜３回（どっちだったかは忘れましたが、いずれにせよ複数回）感染させていたのを記憶しています。

(無題) 削除/引用 No.2482-2 - 2013/10/24 (木) 17:14:35 - 独り言 なんのウイルスですか。レトロウイルスで安定発現株をとっているのですか。アデノで一過性発現でしょうか。 ２回かけることで、倍の効果にはならずとも一回よりから１、２割多くノックダウンできるかもしれません。コントロールも２回ウイルスをかければ、問題ないと思うし、そもそもタイターが高いウイルスなら、あなたが心配している二次的な効果ももっと起こってしまうし。コントロールがちゃんとしているのであれば大丈夫です。免疫関連の研究でなければウイルスの影響はそれほど心配する必要はないと思う。

レトロウイルスを2回以上かけることについて 削除/引用 No.2482-1 - 2013/10/24 (木) 16:35:20 - みな いつも勉強させて頂いています。 ある遺伝子をshRNAでノックダウンしたところ発現量がscrambleと比べて半分程度まで下がりました。もっと下げたほうがいいから、もう一度同じshRNAをもつウイルスをこのノックダウン細胞にかけてみたら、と先輩に言われたのですが、このようなやり方でノックダウン株を構築されている方っておられますか？同じウイルスとはいえ、何度も細胞にウイルスをかけてしまうと、ノックダウンされたこと以外によるフェノタイプが出てきそうな気がするのですが。。。みなさんのご意見をお聞かせください。 よろしくお願いします。

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