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(無題) 削除/引用 No.2467-13 - 2013/10/19 (土) 23:45:26 - U2 お使いの細胞において、PI3K経路に関する遺伝子(PI3KそのものやPTENなど）の変異があるかどうか確認しましたか？ また、無血清培地で培養しても、細胞からPI3K経路を活性化するリガンドが分泌されている場合は、autocrineでシグナルが入ってしまいます。無血清培地で培養している間にAKTのリン酸化がどう変化するか、基礎実験を行った方が良いと思います（例えば、血清除去後３、６、１８、２４時間で調べてみる）。AKTでは実際に調べた事がありませんが、ERKのリン酸化の場合は、細胞によっては３時間で最低レベルになったあと、６−２４時間でリン酸化が亢進してくるケースがしばしばあります。もし分泌タンパクによるシグナルが原因であれば、無血清培地の量をできるだけ増やして、シグナルが最低となるtime pointまで培養後、念のため培地をもう一回フレッシュな無血清培地に変えて刺激してみると、異なった結果が得られるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2467-12 - 2013/10/18 (金) 19:31:39 - とみ qq 様 抗体メーカーの推奨ブロッキング液がスキムミルクでしたので、スキムミルクを使用しています。 これまで他のタンパク質のリン酸化を検出する際も、スキムミルクでのブロッキングで行ってきたので深く考えていませんでしたが、検討してみようと思います。 独り言　様 洗いの回数が十分だとしたら、皆様がおっしゃる様に、リン酸化のバンドが検出できていない可能性が高いですよね。 WBの検討もしてみます。 皆様、ありがとうございました。 またお聞きすることがあるかと思いますが、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2467-11 - 2013/10/18 (金) 19:10:26 - 独り言 > PBSでの洗浄は3回行いました。 > しかし、顕微鏡で細胞を観察すると、血清のカスのような物が残っていたので、それが原因かもしれません… ３回も洗えば、問題ないです。カスのようなものは細胞由来のカスだと思うので、影響するとは思えません。

(無題) 削除/引用 No.2467-10 - 2013/10/18 (金) 18:42:01 - qq 特に問題が無ければ、細胞の名前も出してしまう方がよいです。 「その細胞ならInsulin刺激は入らんよ」とか、「うちじゃ、ちゃんといってるよ」とか、でてきそうなんだけどね。ただまあ、機密事項かもしれんから、そのときは名前だしちゃだめだろうね。 pさんも言ってるけど、リン酸化を見れていないと言う可能性が一番高そうに思います。 ところで、リン酸化抗体でブロットするときは、ブロッキングにリン酸化たんぱく質を多く含むスキムミルクを使わないのが普通で、BSAやPVPなどのブロッキング剤をつかうのだけど、そこは大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2467-9 - 2013/10/18 (金) 18:09:06 - とみ 独り言　様 PBSでの洗浄は3回行いました。 しかし、顕微鏡で細胞を観察すると、血清のカスのような物が残っていたので、それが原因かもしれません… PBSを入れて、軽く揺らしてから除去していますが、洗えていないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2467-8 - 2013/10/18 (金) 17:01:29 - 独り言 無血清培地でありがちな学生のミスは、 10%FBS培地から無血清培地に単に培地交換しちゃうことです。その場合、まだ血清が１％ぐらい残っているため、無血清になっていません。PBSもしくは無血清培地で２回washしてから無血清培地にします。そこのところは大丈夫でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2467-7 - 2013/10/18 (金) 16:32:54 - とみ 返信ありがとうございます。 qq様 細胞にインスリン刺激をかけましたが、Aktのリン酸化に変化が見られませんでした。普段の培養ではD-MEM10%FBSを使用し、無血清培地での処理にはD-MEMを使用しています。 PI3K阻害剤の使用や、無血清培地での細胞増加については確認していませんので、検討してみようと思います。 p様 無血清培地で24時間培養した後、インスリン刺激をかけ、0(未刺激),5,10,15,30分のサンプルを回収し、リン酸化を確認しましたが、リン酸化レベルはどのサンプルでも同程度でした。 おお様 細胞は今回の実験のために購入したものですので、性質が変わっている可能性は低いと思っています。 実際にリン酸化Aktを検出している研究室の方に連絡するというのは勇気がいりますが、連絡してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2467-6 - 2013/10/18 (金) 16:00:27 - qq コントロールをとるのが難しいのでしょうね。 １）あなたの細胞系でAktを刺激する条件（血清、インスリン、PDGF、VEGFなど）でリン酸化が亢進しなかったのでしょうか？ ２）あなたの仕掛けた刺激は、Aktを活性化することが明白なのでしょうか？ ３）wortmanninやLY294002などのPI3K阻害剤でAktのリン酸化を低下（消失）できますが、検討されましたか？ ４）無血清培地には、全く血清を添加していないのでしょうか？その無血清培地の名前はオープンできるのであれば教えて欲しいですね。無血清だけど、何か増殖因子が入っているわけはないですよね。 ５）あなたの細胞は無血清培地で細胞は増殖しますか？増殖しないのであれば、Aktのシグナルも止まっている可能性が高いのではないかと思います。そのばあい、Aktのリン酸化が無くならないのではなく、Aktのリン酸化シグナルをみていない可能性もありえますね。

(無題) 削除/引用 No.2467-5 - 2013/10/18 (金) 15:51:48 - p 基底状態でのリン酸化を見ているのではないかと思います。 Aktを活性化する刺激は増殖因子だけではなく、細胞同士の相互作用も関わってくるので、無血清状態にしたからといって完全になくなるわけではなくて、ある程度はリン酸化してもおかしくはありません。 どちらかというと、刺激後のリン酸化レベルが低いために差が見られないということはないですか。 刺激後の経時変化をとったり(15min-3hなど)、増殖因子の濃度を変えてみるとよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2467-4 - 2013/10/18 (金) 15:35:19 - おお 他のグループの実験の再現性がとれないということですね。 再現性が取れない実験を追求すべきかどうかというのも考慮するべきことにはいるかもしれませんが。 aktはあまり深く追求したことがないのですが、そのプロとコールはメジャーですか? あと細胞株をつかっているなら、研究室ごとに飼っているうちに細胞が変わって、違うbehaiverがみられるというのはよくあります。それでもその実験にしがみつくならば、その実験を発表している研究室から株を分けてもらう手はあるとおもいます。ATCCなどから買い直すという手もなきにしもあらずですが、発表された実験をやったときにはすでに細胞が変化していたりとかあるかもしれません。 あるいはさぶくローンをとって反応するものをさがすとかいうてもありますが、苦労の割りにはむくわれないかもしれません。 そちらの実験でなにかおかしいことがあるかは、ちょっとよくわかりません。同じぷろとこーるで発表しているグループに相談してみるのもてかもしれません。 たまたま同じような実験をしている方がここを見ているといいですけど、、、

(無題) 削除/引用 No.2467-3 - 2013/10/18 (金) 14:08:27 - とみ おお様 はい、無血清培地で24h培養してもリン酸化が見れています。 同じ細胞を使った論文では、無血清培地で培養するとほとんどリン酸化が起こっていません。 なので、私の実験方法に問題があるのではないかと思うのですが… 何か改善すべき点や、考えられる理由等ありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2467-2 - 2013/10/18 (金) 12:37:23 - おお お使いの細胞は、お示しのプロトコールでAktのリン酸化がすでに見られていますか?

無血清培地で処理してもAktがリン酸化され、困っています 削除/引用 No.2467-1 - 2013/10/18 (金) 12:06:24 - とみ 動物細胞を増殖因子等で刺激後、Aktのリン酸化を検出したいと思っています。 細胞をPBS(-)で洗浄後に無血清培地で24時間培養を行い、刺激後に細胞を回収し、WBにてp-Akt(Ser473)抗体で検出を行いました。 しかし、刺激なしの状態でもAktがリン酸化しており、刺激後との差が見られません。 刺激前の無血清培地での処理等に問題があるのでしょうか？ 皆さまがどの様に実験を行っているのか教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いします。

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