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(無題) 削除/引用 No.2466-10 - 2013/10/22 (火) 00:45:19 - mmm 何が測定したいのか分かりませんが、ミトコンドリアのCytochrome C Oxidase Activityを使用予定のferrocytochrome C substrateを用いて測定すれば、保存できるかどうかの判断はできるんじゃないんですか？？ それにデタージェントあり無しでCytochrome C Oxidase Activityを測定することで、ミトコンドリアのintegrityの指標にすることもあるみたいですし。 xingyibio.com/pdf/products/UG_KC310100.pdf

(無題) 削除/引用 No.2466-9 - 2013/10/21 (月) 23:20:58 - おお >[Re:8] 通りすがりさんは書きました : > おおさん > >通りすがりさん、せっかくですから、どの酵素活性についておっしゃっているのか教えていただけませんか?あとそれに関してreferenceと。 > > ミトコンドリア電子伝達系酵素(complexI,II,III,IV)などエネルギー代謝に関わる複合体酵素の比活性はミトコンドリア単離時と凍結保存融解後では大きく(数十%レベルで)異なるというのが常識だと認識しています。比較データがどこに載っているかは現環境で探し出すのが大変なのでできませんが、例えば1960年代(70年代?)に出版された生化学実験講座シリーズ（日本生化学会出版）や分厚い生化学実験の本などには記載されていると思います。 > ありがとうございました。私の参考にした文献では、cytochrome Cなど加える際にintermemenbrane space に行き着かないといけないので、活性測定前に凍結、融解をするというものがあります(よわいでたーじぇんともオプションとしてあります)。なので凍結が悪いという印象がないのです。

(無題) 削除/引用 No.2466-8 - 2013/10/21 (月) 15:45:27 - 通りすがり おおさん >通りすがりさん、せっかくですから、どの酵素活性についておっしゃっているのか教えていただけませんか?あとそれに関してreferenceと。 ミトコンドリア電子伝達系酵素(complexI,II,III,IV)などエネルギー代謝に関わる複合体酵素の比活性はミトコンドリア単離時と凍結保存融解後では大きく(数十%レベルで)異なるというのが常識だと認識しています。比較データがどこに載っているかは現環境で探し出すのが大変なのでできませんが、例えば1960年代(70年代?)に出版された生化学実験講座シリーズ（日本生化学会出版）や分厚い生化学実験の本などには記載されていると思います。

(無題) 削除/引用 No.2466-7 - 2013/10/19 (土) 13:35:28 - おお qqさんべんきょうになりました。

(無題) 削除/引用 No.2466-6 - 2013/10/18 (金) 16:19:44 - qq ＞sucrose, ATP, ADP, sodium succinate, このstorage bufferのコハク酸ATP/ADPは、おそらく、生のミトコンドリアを生かせたままに保存するために入れてあります。ですから、凍結しないでミトコンドリアの機能を測定するために設定されているはずです。ミトコンドリアを取ってきて、（当日、）それをそのまま呼吸活性の測定に使うことを念頭に入れたbuffer組成です。 凍結してミトコンドリアを破壊しちゃダメというわけではないので、使用目的に依るのではないでしょうか。凍結するのであれば、HEPES/sucroseで充分だと思います。 ATP,ADP,succinateは、場合によっては、活性測定に影響する可能性もありそうですから、注意は必要な気がします。 referencesを、なんて言わないでね、面倒だから。必要な人が自分で探してくださいね。

(無題) 削除/引用 No.2466-5 - 2013/10/18 (金) 15:21:41 - おお 膜を介した酵素活性じゃなければ凍結はまず大丈夫ですが(電子伝達系なら)、、、高濃度で凍結するとuncouplingもふせげるといわれています。ただそこまでいくと、どこまで大丈夫かふあんです。 通りすがりさん、せっかくですから、どの酵素活性についておっしゃっているのか教えていただけませんか?あとそれに関してreferenceと。

(無題) 削除/引用 No.2466-4 - 2013/10/18 (金) 14:00:07 - 通りすがり 質問者さんが何を知りたいかによって決まると思います。 　例えば酵素比活性を知りたいのであればミトコンドリア調製後すぐに測定する必要がありますね。いくらキットに保存溶液が付属していても凍結融解はミトコンドリアにとって大ダメージでしょう。そうでないと考えるなら､その推測をまずは確かめる必要がありますね。 　酵素のメカニズムや阻害剤を調べるのであれば保存してもよいと思います｡しかしながらQAの一環としてミトコンドリア調整時の比活性測定は必要ですね。 学生時代にミトコンドリア調整して徹夜したのを思い出します。頑張って下さい。

(無題) 削除/引用 No.2466-3 - 2013/10/18 (金) 12:16:43 - おお わたしはキットを使わずにやったことがありますが、ー80度でシュークロースで浸透圧を調整したバッファーで保存(ほとんどisolationの時のバッファーと一緒です)。ATP ADPやDTTは入ってませんでした。ものによってはBSAを入れているのをみます。なるべく濃い方がmitochondriaの状態がいいようです.私の場合はけんだくというよりは、えんしんして、ペレットを凍結保存してました。complex IVとかの活性ならカップリングの状態とか、膜のダメージはあまりかんけいないですから(膜はむしろ壊してcytochrome Cがアクセスできるようにしないといけないですし)、とりあえず濃い濃度かペレットで凍結しておけばなんとかなったようです。 ATPやADP DTTが入っていると保存状態がいいんでしょうかねぇ。そのへんキットにリファレンスがあるなら教えていただけますか? ただ、呼吸鎖の酸化還元反応をみるならDTTとかちょっと気になりますけど、、、 http://www.nature.com/nprot/journal/v7/n6/full/nprot.2012.058.html?WT.ec_id=NPROT-201206

(無題) 削除/引用 No.2466-2 - 2013/10/18 (金) 10:16:11 - ~ キットによっては、分注して-80℃保存するところまでがプロトコルに組み込まれていますね。 そのキットであれば、-80℃で保存すればそれなりに安定にアッセイに使えるのでしょう。 わざわざ溶液名にstorage bufferとつけているということは、そのキットでもそのbuffer保存条件が書かれていると思いますが。 まずは、キットの添付資料を読まれてはいかがでしょうか。 また、使い方が書かれていないのであれば、そのキットを使う場合は組成情報をもとに、自分で資料を集めて判断する必要があるのでしょう。 新しく系を立ち上げるのに、そのようなキットを選ぶデメリットは少なくないいと思いますが。 少なくとも私なら、安定性に関する資料がない限りはATPや酵素が含まれている溶液を4℃には保存しませんね。

ミトコンドリア単離後の保存について 削除/引用 No.2466-1 - 2013/10/18 (金) 09:36:04 - mito はじめまして。 現在ミトコンドリアの酵素活性を測定するため実験系の立ち上げを考えています。 活性測定のためにまず、ミトコンドリアisolation kitなるもので、ミトコンドリアの単離をするのですが、その最終段階でHEPESやsucrose, ATP, ADP, sodium succinate, K2HPO4, DTTなどが含まれるMitochondria strage bufferでサンプルを調整します。 この次の工程からは活性測定キットにかけるようなのですが、今回ご質問したいのは、このstrage bufferを加えた時点で4℃ないし-20℃でサンプルの保存ができるのかということです。活性測定ではferrocytochrome C substrateを用いて550nmで計測する予定です。 ご経験者の方がいればご助言いただけると幸いです。 よろしくお願いします。

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