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(無題) 削除/引用 No.2463-16 - 2013/10/18 (金) 19:20:51 - 独り言 > 独り言さん > > 私の方法が通常と違うとおっしゃりますが、では通常はどのように行うのでしょうか？ > 言ってる意味がわかりませんので教えてください。 > >[Re:4] HEK293さんは書きました : > というのも、ここに具体的な実験内容を書いてしまうとマズいと思い伏せていたのですが、例えば安定発現株が上手く作ることが出来れば分化が進む、といったことが予想される実験において、上記のとおり、最初に濃度決定してセレクションを行ったのですが、上手く行かなかったのです。 通常の方法だったんですか？てっきり上記のような例えを引き合いにだしていたので、通常の方法ではないのかと思いました。ここで言う通常の方法とはSV40プロモーターにネオマイシン耐性遺伝子が入ったベクターをトランスフェクションして、４８時間後ぐらいからセレクションを開始する方法です。

(無題) 削除/引用 No.2463-15 - 2013/10/18 (金) 17:28:52 - pur そもそもトランスフェクションができているのか、という疑問

(無題) 削除/引用 No.2463-14 - 2013/10/18 (金) 17:04:06 - R >私の方法が通常と違うとおっしゃりますが、では通常はどのように行うのでしょうか？ 言ってる意味がわかりませんので教えてください。 >一般的な方法としてはまず、細胞が死ぬ濃度を決定し、その濃度でセレクションを行う。 例えばであなたが挙げる例が、あなたにフィードバックできないような質問をする意味がわからない。 >提供元にプロトコールを聞くということも考えたのですが、セレクションの方法もくそもないだろうと思い、プロトコールについては聞けていません。 逆に特別な条件でしか出来ないのであれば提供元が教えてくれると思います。 ここに書けないような内容の系なのだから、間違った例えを出すよりそこに聞くのが本筋だと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2463-13 - 2013/10/18 (金) 09:56:21 - HEK293 ~さん おっしゃる通りです。 その実験をまずやってみたいと思います。 アドバイスありがとうございます。 独り言さん 私の方法が通常と違うとおっしゃりますが、では通常はどのように行うのでしょうか？ 言ってる意味がわかりませんので教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2463-12 - 2013/10/17 (木) 17:16:58 - 独り言 少し通常とは異なる方法で行っているようですが、その方法が全く違うたとえ話でしか話せないのでは、一体どのようなコメントを期待しているのでしょうか。 私も通常とは違う方法で安定発現株を作成したことありますが、その場合はトランスフェクション後５日後に薬剤を入れて、セレクションを開始したら、安定発現株がとれたことがあります。原理的に考えると、その方法は薬剤耐性遺伝子が発現するのに通常よりも時間がかかると思ったので。まぁ、その方法があなたと同じかわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.2463-11 - 2013/10/17 (木) 12:16:42 - ~ >約２週間セレクションしたのですが、その間、２日に１回の頻度で新たなジェネティシン入りメディウムに交換しています。 この条件だと親株はどうなることが事前検討でわかっていて、遺伝子導入細胞はどうなったのですか？ �@親株が薄撒きの条件で死ぬギリギリの濃度を調べておく �Aその条件で親株と遺伝子導入細胞をならべてセレクションする （できれば蛍光タンパク質発現ベクターも並べて入れて、非破壊検査で遺伝子導入が分かるようにしておく） を行っていれば、ここに書かれている？のついた文の全ての回答が、手元にデータとしてあると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2463-10 - 2013/10/17 (木) 11:57:36 - おお もともと薬剤耐性遺伝子が入っている細胞にそのプラスみどをいれているってことはないでしょうね。。。 HEK293TはG418耐性ですよ。 でどうもやりとりでよくわからなくてもどかしいのですが、出来ないっていうのは、細胞が死ななくってセレクションできてないっていうことなのか、細胞が死滅してしまって耐性かぶがえられないってことなのか、、、

(無題) 削除/引用 No.2463-9 - 2013/10/17 (木) 11:47:44 - HEK293 monさん、~さん 例えばの話です。 私の実験では分化は関係ありません。たとえが悪かったです。その件に関して色々サゼッションをいただいたのに大変申し訳ありません。 要するにベクターがちゃんと入った安定発現株が作成できれば見た目でわかるということです。 残念ながら私が行った限りでは出来なかったです。 培地の色も黄色っぽくなりますが気にせず実験していました。 約２週間セレクションしたのですが、その間、２日に１回の頻度で新たなジェネティシン入りメディウムに交換しています。 提供元にプロトコールを聞くということも考えたのですが、セレクションの方法もくそもないだろうと思い、プロトコールについては聞けていません。 逆に特別な条件でしか出来ないのであれば提供元が教えてくれると思います。

(無題) 削除/引用 No.2463-8 - 2013/10/17 (木) 11:45:42 - おお G418は確かに1週間ぐらいかかりますね。なのでそれぐらいで死滅する濃度で1週間たってもいきている細胞は安定導入されているとみていいという目安ができるわけです(実際には安定導入されてなくてもプラスみどが入っていれば細胞がふえるので、遺伝子を導入したときは少しセレクションのこうかは遅れるかもしれません)。 細胞が接触している場合細胞間でタイトジャンクションなど物質が通れるようになっている場合もあると思いますので、導入後、細胞をけいだいしてから、セレクションをはじめるとセレクションが早くなったりもしますが、導入効率がわるかったり発現させる遺伝子によっては、得られるクローン数がかなり落ちることはあるかもしれません。 セレクションされないというのはどういうことをおっしゃっているのかよくわからないですが、死んだ細胞が現れないようであれば、あるいは細胞の増殖も落ちないようであれば、薬剤の濃度はあげた方がいいかとおもいますが、、、 逆に全部死んでしまうようであれば、下げる方がいいかと(ただし、導入効率その他に問題がないときは).

(無題) 削除/引用 No.2463-7 - 2013/10/17 (木) 11:44:20 - pur 細胞によって使用濃度が異なることを考えれば、分化した細胞では許容濃度が異なる事が予想されますよね。 分化した細胞で薬剤の許容濃度が低ければ、セレクションできたはずの細胞も死んでしまいます。 分化するまでどのくらいの時間が必要かわかりませんが、選択に時間がかかるG418よりも短期間でも効果があるPuromycinなどで1-2日選択して後は除くor濃度を下げる、という方法もあります。 ベクターの組換えが面倒ですが誘導発現系にしたほうが、いろいろ楽だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2463-6 - 2013/10/17 (木) 11:40:40 - ~ >それでセレクションされていないようであれば濃度を下げてセレクション きちんと細胞が死ぬ濃度を調べたうえであれば、それ以下の濃度にしてしまうと単に薬剤で死なない細胞も取れてしまいますよね。 >安定発現株が上手く作ることが出来れば分化が進む 遺伝子導入による分化で増殖が止まるのであれば、Tet-ON等の誘導系を使うのも手かもしれません。 構築するのは手間ですが、一度作れば好きな時に誘導をかけて多量の分化した細胞を得ることができます。 >ベクター自体は提供していただいたものですので上手く行くことは提供元も確認済 これが同じ細胞で分化を確認済みだという話であれば、プロトコルが十分にトランスファーされていないか、先方と同じ操作ができていないということになるかと思いますが。 提供元に細胞や培地、血清ロット、ディッシュ、継代タイミング等の条件を確認されてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2463-5 - 2013/10/17 (木) 11:25:35 - mon >[Re:4] HEK293さんは書きました : > それでセレクションされていないようであれば濃度を下げてセレクションするということでよろしいのでしょうか？ 濃度を下げるとベクターが入っていない細胞も増えますよ。 ちなみに、細胞が分化すると増殖は止まる、または著しく遅くなりますけど、選択上問題無いのですか？ また、一般的に実験用の細胞選択用抗生剤は、精製度が低くロットによって力価が異なりますので注意が必要です。特にG418(ジェネティシン）粉末の力価は、60~80%(w/w)です。 G418は死滅するまで1週間以上必要な細胞株が多く、その間も細胞はある程度増えてきますので面倒な薬剤です。培地もG418添加だけで結構黄色になりますしね（そのため25~50mM HEPESを添加することも多いです）。 高価な事もあり、選択（死滅濃度）で1週間ほど選択し、個々の細胞程度まで死滅したら、濃度を1/2に落として、コロニー形成を促す(?)ことが多いです。

(無題) 削除/引用 No.2463-4 - 2013/10/17 (木) 10:51:20 - HEK293 >>おおさん 例えばの細胞としてHEKと書きました。 一般的な方法としてはまず、細胞が死ぬ濃度を決定し、その濃度でセレクションを行う。 それでセレクションされていないようであれば濃度を下げてセレクションするということでよろしいのでしょうか？ というのも、ここに具体的な実験内容を書いてしまうとマズいと思い伏せていたのですが、例えば安定発現株が上手く作ることが出来れば分化が進む、といったことが予想される実験において、上記のとおり、最初に濃度決定してセレクションを行ったのですが、上手く行かなかったのです。 ベクター自体は提供していただいたものですので上手く行くことは提供元も確認済ですのでなぜうまくいかなかったのかと思い質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.2463-3 - 2013/10/17 (木) 10:45:12 - おお HEK293なら参考になるものはいくらでもあるんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.2463-2 - 2013/10/17 (木) 10:42:47 - おお >[Re:1] HEK293さんは書きました : > 添付文章には大体の最適濃度がかかれていますが、一度、使用する細胞が死ぬ濃度を事前に決定しておき、その濃度でセレクションを行う方が良いのでしょうか？ yes > > 逆に抗生剤の濃度が高すぎることでベクターを含んだ細胞が得られないことなどあるのでしょうか？ あります。

薬剤による細胞のセレクション 削除/引用 No.2463-1 - 2013/10/17 (木) 10:38:14 - HEK293 ある発現ベクターを一過性トランスフェクションし、48h後に薬剤を添加してベクターを持った細胞のみを増やそうと実験しています。 この時、薬剤の濃度はどのようにして決定するのでしょうか？ 添付文章には大体の最適濃度がかかれていますが、一度、使用する細胞が死ぬ濃度を事前に決定しておき、その濃度でセレクションを行う方が良いのでしょうか？ 逆に抗生剤の濃度が高すぎることでベクターを含んだ細胞が得られないことなどあるのでしょうか？

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