全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.246-6 - 2012/03/03 (土) 15:33:08 - nb Harmonia様 そうですか、RNA量が多ければ出るってものでもないのですね。私も量をふって検討しましたが、量を多くしてばかりでした。 RT-PCRでも検討はしましたが、やはりだめでした。不純物が多いと、それだけでやはりPCRは阻害されてしまうのですかね。次回はなるべく不純物を除ける様にプロトコールを変えて、検討してみます。有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.246-5 - 2012/03/03 (土) 09:25:19 - Harmonia リアルタイムPCRでなく、通常の手順のRT-PCRではどうでしょうか？ ぼくは、RT-PCRで産物が見えなかったとき、逆転写反応のRNA量を振って、最適化しました。RNA量が多ければ出るってことでもないです。 ちなみに、持込みRNAがPCRを阻害するらしいけど、RNaseHは使っていません。

(無題) 削除/引用 No.246-4 - 2012/03/03 (土) 08:30:43 - nb AP様 なるほど、白いのは多糖類なのですね。確かに不純物が多くなりそうな組織なので、教えて頂いた様な試薬を用いて、除去した方が良さそうです。有難うございます。 ただ御指摘の様に、不純物が多いのと、PCRでβアクチンすら検出されないというのは、別問題ですよね。。印象として、沈殿物の大部分が不純物の様な気もするのですが、不純物が多いと見かけのRNA濃度の数値がくるう事もあるのですかね？ あと実は不純物に塩が多いと、Tmが高くなりやすいとの事で、アニーリング温度を変えたりしてみましたが、結局だめでした。 やはり何故検出できないのか、未だに分からないので、また何かアドバイスがあればよろしくお願いします。 aaaa様 有難うございます。おっしゃる通りと思いますが、乾燥させ過ぎない様に気を付けてやっていますがだめでした。通常の組織や細胞からならRNA抽出できるのですが、今回の組織は全体の中の細胞の割合が少なく、結果的に不純物が多くなっていると思っています。この様な時に、何か考えられる原因があれば、またお願いします。

(無題) 削除/引用 No.246-3 - 2012/03/03 (土) 06:50:29 - aaaa 乾燥させすぎではないですか？ 70%エタノールを完全に除去したら、乾燥させずにすぐに溶解しても問題ありませんよ。

(無題) 削除/引用 No.246-2 - 2012/03/02 (金) 18:45:40 - AP 白いのは塩ではなくて多糖類（グリコゲンなど）でしょう。 RNA-Beeは知りませんが、おそらくAGPC法の市販試薬だと思います。 AGPC法は多糖類が取り除けないので、改良法が一般的になってきています。 それはプロパノールを減らして、RNA precipition solutionという高塩濃度の溶液を加えて沈殿させるものです。RNA precipition solutionは自作できますが、製品も各社から出ています。 RNA precipitation solution http://nippongene.com/pages/products/extraction/high_salt_pre/index.html http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?catcd=B1000736&subcatcd=B1000356&unitid=U100006020 RT-PCRがかからないのは、また別の問題かもしれん。

RNA抽出と塩 削除/引用 No.246-1 - 2012/03/02 (金) 18:30:59 - nb ある組織からRNAを抽出し、PCRをしています。 簡易なプロトコールを書きますと、 組織にRNA-Beeを加えホモジナイズ→クロロホルムを加え遠心→上層を回収し、イソプロパノール沈殿→70%エタノールを加え、遠心(２回)、乾燥 という流れです。 しかしながら、この方法では最後の沈殿物が、真っ白な沈殿物の塊（透明ではない）となっており、塩が多量に混じっていると思います。 そしてこのRNAをcDNAとし、リアルタイムPCRをしたところ、βアクチンすら検出されませんでした。（組織中の細胞の割合は、かなり低いものを使用しています。しかしRNA濃度測定では、問題なく抽出できている様な数値だったのですが・・） そこで質問なのですが、塩が多い時はエタノール沈殿や、70%エタノールを用い、塩を減らす様にすべきと理解していますが、塩が多すぎるといけない理由は何なのでしょうか。 つまり今回の様に、塩が多すぎると、PCRでβアクチンすら検出されないという事があり得るのでしょうか。 何が原因で抽出できなかったのか悩んでおり、よろしくお願いします。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---