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in situ後のRNA抽出 トピック削除
No.2447-TOPIC - 2013/10/11 (金) 12:09:03 - メダカ
サンプルが小さいため切片作製時にサンプルが確認できないことがあります。なので、in situにより血管全体を染色後、切片にしRNA抽出を行おうと考えています。しかし、in situ後に正確なRNAを抽出することは可能でしょうか。in situの毒性はRNAの質に影響はないのでしょうか。
　
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No.2447-6 - 2013/10/12 (土) 11:36:57 - ぺーぺー
同じく、普通のWISH条件ではRNA抽出は不可能だと思います。因みに私はもう一方のお魚をやっていますがRNase処理はやっていません。
ポイントさえ押さえれば、結構ラフにやっても再現性が得られる実験なので、最終サンプルに残るRNAは些少であり、操作によるバラツキを吸収するほどの検出力なのであろうとと愚行いたします。

その上で二つ考えました。
(1)少なくともhybridizeするまではRNA断片は残っているわけだから、その後の処理を迅速に進めれば、あるいは可能かも？
(2)hybridizeした二本鎖は酵素的には安定になるので、抗体反応まで少なくとも残っている。多分抗体のmobilityを考えれば最後まで残ってるんじゃないかと。つまり、目的の遺伝子に対する未標識のアンチセンスRNAでマスクして、RNase処理をすればマスクした分子だけ最後まで残るんじゃないかと妄想しました。そこから常法で抽出できるのかとか、そもそもかなりトリッキーなのとか色々問題があるので自分ならやりませんが……。

結局、時間があるのなら目的の組織に蛍光タンパク質を発現するTgを作って、なにも処理せず切り出すのが一番説得力があると思います。

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No.2447-5 - 2013/10/12 (土) 00:31:11 - AA
質問者さんのお名前からするとメダカでの実験なのでしょうか？

免染した切片からレーザーダイセクションで切り出して
RNAを回収する実験のイメージなのかと勝手に推測し、
"in situ"というのも"in situ hybridization"だと解釈しますが、

ISHでマーカーgeneで染色・可視化して切り出す実験ということでしょうか？

プロトコルにもよりますが、ISHはhybridizeのあとに
RNaseAによる1本鎖RNAの分解除去ステップが入っていることがあります。
未ハイブリのプローブ除去のためですが、
この操作を挟んでいれば当然他のRNAも壊れていると考えたほうが良いでしょう。
ライカなどが教えてくれますが、そもそもimmuno-LMDの場合でも、
以下に素早く、手順を少なく染色するかに苦心しているくらいですので、
ISHのような長い操作を経た組織では使用に耐えるRNAを精製できないと思います。

(無題) 削除/引用
No.2447-4 - 2013/10/11 (金) 15:22:33 - おお
もともとのサンプルの状態としてどういうのを考えているのかもわからないんだよね。。。サンプルが小さいといっても切片作るのにどの様にサンプルをよういしたの。見えないけどあるという前提で見えないものを使っているのでしょうか、、、

(無題) 削除/引用
No.2447-3 - 2013/10/11 (金) 15:14:18 - AP
目的、やろうとしている実験がまるっきりわかりません。
・in situはin situ hybridizationのこと？
・血管を染色したり、切片を作製するのはなんのため？（特定の細胞種などを分取したいの？）
・その場合、なぜISHを選ぶの？
・「正確な」RNAってどんなもの？（何について「正確」なの？）
・RNAの使用目的は（それによってrequirementが違うでしょう？）？

in situ後のRNA抽出 削除/引用
No.2447-1 - 2013/10/11 (金) 12:09:03 - メダカ
サンプルが小さいため切片作製時にサンプルが確認できないことがあります。なので、in situにより血管全体を染色後、切片にしRNA抽出を行おうと考えています。しかし、in situ後に正確なRNAを抽出することは可能でしょうか。in situの毒性はRNAの質に影響はないのでしょうか。
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