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(無題) 削除/引用 No.2442-8 - 2013/10/18 (金) 16:08:48 - K 凍結融解とかでAmpが失活してるのでは？ フロストフリーの、つまり家庭用とか自動霜取り装置のついてるフリーザーに入れて半年とか1年とかたってませんか？ Ampを作り直して再現されるかみてみるといいかと。

(無題) 削除/引用 No.2442-7 - 2013/10/10 (木) 23:26:17 - おお RNAのほうはキットを使用しているようなのでだいじょうぶじゃないかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.2442-6 - 2013/10/10 (木) 19:36:29 - qq ＞そして、吸光度計でDNA濃度を測定したところ、十分な収量が得られたのは6つの内2サンプルのみであり、残りはその10分の1程度でした。 DNAをミニプレップして、まず最初にUVを測定するのは、ダメじゃないけど、なんとなく嫌な感じです。 １）吸光度計で測定したDNA濃度は控えめにいってDNA+RNAの濃度であること、 ２）DNAといってもプラスミドとは限らないで、大腸菌のゲノムDNAだらけという可能性もあるということ。 以上の可能性は制限酵素切断ありなしで電気泳動するとおよそ判ります。そのあたりは否定できている、かな？

(無題) 削除/引用 No.2442-5 - 2013/10/10 (木) 17:43:23 - AP >寒天から液体に移す際プラスミドの脱落した菌体が多数含まれており、液体培地中で耐性菌によりAmpが分解されたため、プラスミドの脱落した菌体が増えてしまう結果になったのではと考えています。 ちょっと違うと思うな。 ちゃんとプラスミドを保持している一個の細胞の子孫であっても、抗生物質の選択圧が弱まるとかなくなると、二次的にプラスミドをうしなった細胞が生まれてくるということ。選択プレートからコロニーをひろった段階で、プラスミドを失った（あるいは最初から持たない）細胞が混じっているということではない。 なんで、プラスミドが失われるかはよく知らないけれど、 ・染色体分配装置のようなものがないので、細胞分裂ごとにプラスミドが娘細胞に均等に分けられるわけではない。多い少ないの偏りができたときに、少なくなった奴に選択がかからなければ、やがてプラスミドを失ったやつも出てくる（そして余計な遺伝子が負荷をかけない分、増えやすい）。 てところか。 同様の論議は、F因子にもふるくからあって、F+がF-と接合すると子孫はすべてF+になるので、やがて世界からF-は駆逐されてF+だけになってしまうはずだけれど、実際はある一定の頻度でF-は存在する→F+細胞からF因子が脱落することがあるということ。だからこそ、F'+の宿主細胞（JM109やXL1-Blue)なんかを調製するときは、F'を持っている細胞を選択してやるわけだ。

(無題) 削除/引用 No.2442-4 - 2013/10/10 (木) 17:29:16 - seven 液体培養が長すぎて菌が死んでいるのでは？ 収量が少ない場合は、菌が多すぎたり試薬が古かったりでアルカリlysisがうまくいってないことも原因として考えられます。

(無題) 削除/引用 No.2442-3 - 2013/10/10 (木) 13:30:57 - おお 24時間はちょっと長すぎるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2442-2 - 2013/10/10 (木) 13:28:37 - おお 6個のうち2つっていうのはチョット異常に感じるので、そのプラスみどが大腸菌の増殖に不利に働いているか、手技的に問題があるか、、、

Amp含有液体培地でのプラスミド脱落 削除/引用 No.2442-1 - 2013/10/10 (木) 13:20:13 - 田丸 ミニプレ時の低収量の原因について質問があります。 先日、あるプラスミド(pUC ori)をDH5αで増やそうと思い ↓形質転換 ↓寒天培地(Amp),24h ↓6つほどコロニーをピックアップ ↓液体培地(Amp),24h ↓ミニプレ(Q社キット) という操作を行いました。 そして、吸光度計でDNA濃度を測定したところ、十分な収量が得られたのは6つの内2サンプルのみであり、残りはその10分の1程度でした。 ミニプレ前の液体培地中の菌濃度は全て同程度でした。 そこで御聞きしたいのですが、このような結果になった原因は何が考えられるのでしょうか。 個人的には、過去のトピック等から、寒天から液体に移す際プラスミドの脱落した菌体が多数含まれており、液体培地中で耐性菌によりAmpが分解されたため、プラスミドの脱落した菌体が増えてしまう結果になったのではと考えています。 ただ、ここで気になるのが液体培地に移した直後はAmpによる選択がかかっているはずであり、非耐性菌を持ち込んでいたとしても大多数が死滅してしまうのではないか？という点です。 Ampは殺菌的な効果がアルわけでは無いので、Ampが分解されるまでの間非耐性菌は息を潜めており、Ampが無くなるやいなや息を吹き返し増殖を始めるということなのでしょうか？ この点についても意見を頂きたいです。

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