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(無題) 削除/引用 No.2440-13 - 2013/10/10 (木) 21:33:57 - 名無し なんかの刺激で細胞内のユビキチン修飾系が動いて、細胞内蛋白質のユビキチン化の亢進が起きたとき、それはwhole cell lysateのIBでも見えることはあるけど、そのときのユビキチン化細胞内蛋白質の中に調べてる特定の蛋白質も含まれるか、つまり着目する特定の蛋白質のユビキチン化が亢進しているかどうかは分からないとおもう。一番簡単な方法の６xHis-Ubをトランジエントで発現させて、濃いウレアあるいはグアニジン塩酸塩とかの変性剤含むバッファーで抽出してそれをニッケルビーズで部分精製したもの泳動して自分の調べたい蛋白質の抗体でWBすればいいんじゃね。高分子量化したその蛋白質がみえるよ。 あと還元でユビキチン化が消えたらUb修飾でも、それはいわゆるユビキチン化のイソペプチドボンドじゃなくて、システイン残基とかとのチオエステルボンドで結合してるUbの方だと判断出来るので、それはそれで意味あるとおもう。 たとえSDS lysis bufferとか最強系bufferで抽出するにしてもNEMとかIAA入れたほうがいいみたい。イソペプチダーゼ、あれ半端なく強い。気をつけないとばんばんUb外す。

(無題) 削除/引用 No.2440-12 - 2013/10/10 (木) 13:19:56 - おお 過剰発現系が使えるようなら、場合によっては楽かもしれませんね。万能なアプローチでないので実験によっては適切ではないかもしれませんけど。 ユビキチン化されないようなmutantがあればその比較で、高分子にシフトしたバンドが変異たいでは現れないというのを、tagをつけた過剰発現で同時にやると、直接ユビキチン化を証明しなくても説明が可能かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2440-11 - 2013/10/10 (木) 12:20:07 - ガジュマル・パキラ >[Re:7] TSさんは書きました : > 私も興味あるので教えてください。 > 免疫沈降しないと目的タンパク質のユビキチン化を特定できない気がするのですが > そんなことはないのでしょうか。 確かにIPを行ってユビキチンの抗体で検出した方が確実ですし K63、K48、linearを特定する場合にはIPか免疫染色を行うという 方法がベストだと思います。 ただ、脱ユビキチン化酵素阻害剤を加えていない状態で高分子のバンドが消えるもしくは弱くなっていれば、ユビキチン化のバンドであるということがうっすら証明できる気もします。あくまで推測ですので、一般的にはどのように考えられているのかわかりません。 ＞おおさん 丁寧な説明有難うございます。 Ubのバンドが得られるように少し粘って実験してみます。

(無題) 削除/引用 No.2440-10 - 2013/10/10 (木) 11:09:27 - TS >そう申し上げているわけでなくすでにユビキチン化のほうこくがあって、 >上下のシグナルや状況から考えて、ユビキチン化と判断できるならそれで良い >こともあるだろうとていどです。 おお様: ありがとうございます。 やはりIBだけで特定するのは難しいが、 他のデータや検証を踏まえて、総合的に判断することはできる場合もあるということですね。勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.2440-9 - 2013/10/10 (木) 04:37:26 - おお >[Re:6] ガジュマル・パキラさんは書きました : > ＞おおさん > > 確かに高分子にいっぱいバンドがでますよね。 > （特にMG132を加えるとバンドがはっきりしますよね。） > > 膜タンパクを効率よく回収できるバッファーを使用し、 > 脱ユビキチン化酵素阻害剤を加えて、 > 流すタンパク量を増やせば検出できるのでしょうか？ それは対象の蛋白、細胞、実験系その他にもよるので、はいOKとはいいませんが、ぶんけんによっては単なるlysateのWBでみているとおっしゃっているので、それで見れる系ならみれるし、目的の蛋白、特にユビキチン化したものが、エンリッチメントできるなら、検出に有利だし、もちろん脱ユビキチン化によるリサイクルされている形であればそれを 止めれば検出に有利だろうし、ユビキチン化からプロてあソー厶で壊されるなら、そのインヒビターをいれればゆうりだろうし > ＞また検出限界は検出試薬、抗体などでもパラメーターになりますので、、 > どういうことですか？ ケミルミの試薬もオリジナルのものからECLになりさらにつよいECL+、いまはそれよりさらに強いものもでまわってます。 抗体も非常に強く検出感度がいいものから、そうでないものかであるとおもいますので、そう言うことがえいきょうするだろうなぁとおもってるのです。

(無題) 削除/引用 No.2440-8 - 2013/10/10 (木) 04:11:12 - おお >[Re:7] TSさんは書きました : > 私も興味あるので教えてください。 > 免疫沈降しないと目的タンパク質のユビキチン化を特定できない気がするのですが > そんなことはないのでしょうか。 ユビキチン化されている報告がない蛋白でそれを証明するなら、一度へんせいさせて、IPをおこないWBで確かめる必要があります。 たんにWBでユビキチン化したバンドが検出できるかどうかということなら、ユビキチン化でサイズがシフトしたバンドは検出感度さえ担保すれば検出できるでしょうというふうにかんがえています。 > IBのみで検出するというのは、 > 高分子方向へずれたらユビキチン化という判断をするということですか？ > 他の修飾の可能性とかは気にしなくても良いというのが > 一般的に通用しているのでしょうか。 そう申し上げているわけでなくすでにユビキチン化のほうこくがあって、上下のシグナルや状況から考えて、ユビキチン化と判断できるならそれで良いこともあるだろうとていどです。

(無題) 削除/引用 No.2440-7 - 2013/10/10 (木) 00:27:23 - TS 私も興味あるので教えてください。 免疫沈降しないと目的タンパク質のユビキチン化を特定できない気がするのですが そんなことはないのでしょうか。 IBのみで検出するというのは、 高分子方向へずれたらユビキチン化という判断をするということですか？ 他の修飾の可能性とかは気にしなくても良いというのが 一般的に通用しているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2440-6 - 2013/10/10 (木) 00:04:09 - ガジュマル・パキラ ＞おおさん 確かに高分子にいっぱいバンドがでますよね。 （特にMG132を加えるとバンドがはっきりしますよね。） 膜タンパクを効率よく回収できるバッファーを使用し、 脱ユビキチン化酵素阻害剤を加えて、 流すタンパク量を増やせば検出できるのでしょうか？ 還元剤のことは忘れてください(笑) ＞また検出限界は検出試薬、抗体などでもパラメーターになりますので、、 どういうことですか？

(無題) 削除/引用 No.2440-5 - 2013/10/09 (水) 23:43:00 - おお ユビキチン化は還元、非還元は関係ないと思いますけど、、

(無題) 削除/引用 No.2440-4 - 2013/10/09 (水) 23:41:34 - おお >[Re:3] ガジュマル・パキラさんは書きました : > 自分がユビキチン化のバンドが得られないと考えていた理由は、 > 一般的なプロトコール通りライセートにサンプルバッファーを加え > 還元剤を入れて、数分間煮沸するという方法しか知らなかったためだと思います。 この方法でも存在するなら検出感度だけの問題ですよね。 例えばそうやって用意したものをユビキチンの抗体で検出すると高分子にいっぱいバンドがでてきます。実際スメアーにみえます。ということはユビキチン化したタンパクはIPしなくても検出可能といえるとおもいます。個々のれいでは量がWBの検出限界以上を載せれるかどうかのもんだいだけだとおもいます。また検出限界は検出試薬、抗体などでもパラメーターになりますので、、

(無題) 削除/引用 No.2440-3 - 2013/10/09 (水) 23:12:58 - ガジュマル・パキラ おおさん、書き込み有難うございます。 過去のトピック「非還元状態の煮沸について」を見て 少しわかってきた気がします。 自分がユビキチン化のバンドが得られないと考えていた理由は、 一般的なプロトコール通りライセートにサンプルバッファーを加え 還元剤を入れて、数分間煮沸するという方法しか知らなかったためだと思います。 もう少し勉強してみます。 >らいせーとの取り方を工夫してゆびキチン型がエンリッチできるなら >膜に局在するなら膜フラクションが優先的に溶出できるようなほうほうとか)、 >そういう工夫はあるかもしれません。 確かにTRAF2やRIP1のユビキチン化は小胞体の膜上で起こるという論文がありました。 heavy membrane fractionを用いて検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2440-2 - 2013/10/09 (水) 22:18:57 - おお >[Re:1] ガジュマル・パキラさんは書きました : > 普通のウエスタンを行うとユビキチン化されたバンドは > 得られないと思うのですが > 何か特別な方法があるのでしょうか。 なぜ、得られないと思われているのかよくわからないです。理論的にはバンドが検出されてもおかしくないですよね。 量的に難しいのではないかといわれると、それは細胞のコンディションやターゲットによるとおもいます。細胞によってもちがうかもしれません。 らいせーとの取り方を工夫してゆびキチン型がエンリッチできるなら(膜に局在するなら膜フラクションが優先的に溶出できるようなほうほうとか)、そういう工夫はあるかもしれません。

ユビキチン化の検出 削除/引用 No.2440-1 - 2013/10/09 (水) 19:35:46 - ガジュマル・パキラ 現在、NF-kBの活性化について検討を行っています。 TNF-aで刺激した際のTRAF2、RIP1のユビキチン化を ウエスタンブロットで見たいと思っています。 一般的には、TRAF2やRIP1で免疫沈降し、 そのユビキチン化を検出する方法を行うと思うのですが たまに回収したタンパクで直接ウエスタンブロットを行い 目的のタンパクのユビキチン化を検出している論文があります。 普通のウエスタンを行うとユビキチン化されたバンドは 得られないと思うのですが 何か特別な方法があるのでしょうか。 ご教授願います。

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