はじめまして。
新しく次世代シーケンサーの実験を行っているものです。run前のDNAライブラリーの作製で問題が起きたのでアドバイスをください。
野生動物の組織からRNAを抽出しビーズを用いてmRNAを抽出しました。抽出したmRNAを鋳型にcDNAを合成、さらにklenow fragment を使用して二本鎖DNAの合成をしました。
この時の収量が少なかったため、Raw Sewage Gsrbors Divese Viral Population という論文を参考にPCRで増幅させたサンプルを使用することにしました。
4サンプルあり一番多いもので140ng、1番少ないもので68ngでスタートしました。バイオアナライザーでフラグメントサイズをチェックしたところ、フラグメントサイズが大きかったのでコバリスを使用して断片化を行い、ion torrentの推奨する方法にて末端の平滑化を行いAMpureで精製しました。
ここでもう一度アナライザーでチェックし、フラグメントサイズが小さくなっているのを確認し、ion torrentのキットを用いてBarcode adaptor を結合させ、AMpureで精製。2%E-ゲルを用いて440bpほどにサイズセレクションを行い、同じくion torrent のキットを使用しマニュアルに従い8サイクルのPCRをかけてアナライザーでチェックを行いました。
ここで不思議なことに440bpでサイズセレクションしたのですが、2つのピークが現れました。一つは目的サイズより少し小さい(おそらく電気泳動止めるのが少し早かった)400bp、もう一つはちょうど100bp少ない300bpにピークがありました。どちらもフラグメント量は変わらず、4サンプルすべてに存在し、サンプルによっては短いフラグメントのほうが多いものもありました、
そこでもう一度ゲル上で再度サイズセレクションを行ったのですが、300bpにバンドは現れず。とりあえず300bpと400bpを取り出し、アナライザーにかけたところ、300bpで切り出したところはピークが現れず、400bpには変わらず2つのピークが現れました。
ゲル上で見えないサイズが、アナライザーでのみ検出される。こんなことはあるのでしょうか…技官の方と相談しても解決策が見つからず、実験がストップしています。
似たような現象が起きた方など居ましたら、アドバイスお願いします。
また、プロトコルの不備等あったら、そちらに関してもご意見お願いいたします。
よろしくお願いいたします。 |
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