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(無題) 削除/引用 No.2423-6 - 2013/10/05 (土) 02:26:15 - おお >ラボとかの単位で明文化した決まりをつくってくれれば、実験やる側としては余計な事を考えなくていいなぁなんて思います。 まあじょうきょうによるとおもいますけど、一度けいだいすればリカバーするのでよいときめたとして、なんらかの都合で一度けいだいしても細胞がぐずっていて、それを気にせずつかってたりして、めもあてられない結果になったしまったらとか考えると、、、、

(無題) 削除/引用 No.2423-5 - 2013/10/05 (土) 01:05:27 - 96w microRNAの実験をされているんですね。inhibitor入れたらターゲットの発現は上がるんですっけ。どちらにしても、siRNAと同じような条件で入るでしょうから、コントロール用のsiRNAが役に立つと思います。 >細胞は起こしたあと何回かけいだいして安定な状態になってから使うのが一般論です。 これは細胞を使った実験の一般論ですよね。継体数もある程度までにするように言われますが、ラボとかの単位で明文化した決まりをつくってくれれば、実験やる側としては余計な事を考えなくていいなぁなんて思います。 一般論はあまり無いなんて自分で書いてしまいましたが、リバース法は時間の短縮になるけど、毒性が強くでることがあるなんて言われますよね。

(無題) 削除/引用 No.2423-4 - 2013/10/04 (金) 01:08:31 - おお 細胞の中に効率的に入っているのかがわからなければ、トランスフェクション自体を改良する余地があるかわからないですよね。 細胞は起こしたあと何回かけいだいして安定な状態になってから使うのが一般論です。

(無題) 削除/引用 No.2423-3 - 2013/10/04 (金) 01:02:12 - 実験はじめました 96wさん 早速ありがとうございました。 現在microRNAをやっていてInhibitorとMimicを用いてやっています。 細胞によってだいぶ違うのですか・・・・。 自分の細胞は珍しい細胞を使っていてだいぶ大変そうです。 はじめの細胞をまくときの液体窒素から戻したばっかりの細胞がいいのかもしくは継代中の細胞でいいのかなどの細胞条件に差はありますか？

(無題) 削除/引用 No.2423-2 - 2013/10/04 (金) 00:34:15 - 96w inhibitorってsiRNAのこと？それとも短鎖RNAベースのなにかかな？ ゆっくりやるのが一番いいんじゃないかなぁ。まずはポジティブコントロール、ネガティブコントロールsiRNAって言って売っているものを買って条件検討。ポジティブコントロールは細胞が死んだりして、フェノタイプがすぐわかるものがいいと思います。 トランスフェクションの条件は細胞種によって違うらしいし、一般論はあまりないんじゃないかなぁ。特に珍しい細胞を使っているのなら、自分で頑張って条件決めするしかないと思います。細胞名とか出せば、もしかしたら誰か上手く行った条件を教えてくれるかも、ですね。

トランスフェクション 削除/引用 No.2423-1 - 2013/10/03 (木) 23:49:03 - 実験はじめました はじめてトランスフェクションをしています。細胞にInhibitorを導入し蛋白レベルでそのターゲット蛋白の発現の抑制を見たいのですが、いくらやってもうまく発現を抑制できずコントロールと同じ結果になってしまいます。 接着細胞でLipofectamine RNAiMAXを用いています。 現在Reverse Transfectionにて行っているのですが、細胞が60-80％の時に細胞を回収し12Well plateにInhibitorと一緒に混ぜて細胞培養し24時間後に培養液を換え48時間後に蛋白抽出を行っています。 細胞ですが、液体窒素から起こしてすぐに60-80％になった細胞を使うのがよいのでしょうか？もしくは細胞を継代しているもので（そこまで古くないもの）途中で60-80％になったものを使ってもよろしいのでしょうか？どこの状態で細胞を用意するのがいいのでしょうか？ また、Transfectionの方法でReverseとForwardでは差があるのでしょうか？ 幾分実験が初めてのためよくわかりません。 どうか素人の私にご教授いただけたら幸いです。

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