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(無題) 削除/引用 No.2421-5 - 2013/10/03 (木) 18:05:18 - aa 膜貫通タンパク質-P2A-レポータータンパク質の組み合わせなら論文がいくつか見つかったので不可能ではないと思いますが、後ろも膜タンパク質だと難しいのかもしれませんね。 それより、細胞表面に発現していないということですが、どこに局在しているとか、発現したタンパク質がちゃんと切断されているかは確認しているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2421-4 - 2013/10/03 (木) 17:51:04 - AP 遺伝子Aの産物も遺伝子Bの産物も膜タンパク質でari、それらを2Aを挟んで同時に発現させ、それぞれ膜に発現させるという事ですか？ それらの遺伝子産物もそうだと思いますが、膜タンパク質と呼ばれるものは、リボソームで翻訳されながら、シグナルペプチドに導かれてERの膜に貫通し、または内腔に入り、そこで修飾、プロセッシングを受けた後、小胞輸送系にのって運ばれ、膜融合によって細胞膜上に局在するものですよね。膜タンパク質が膜に対してどういうトポロジーをとるか（何回貫通するか、N-in/out、C-in/outなど）は、翻訳の段階で決まってしまいます。 なので、　A-2A-Bが細胞質で翻訳され、AとBに切り離された後にそれぞれが膜に局在するというイメージであれば、ありえないというしかないです。

(無題) 削除/引用 No.2421-3 - 2013/10/03 (木) 17:09:42 - pa 失礼しました、細胞表面への移行に必要なシグナルというつもりでした。 2Aペプチドの後ろのタンパク質にはN末端にプロリンが一つ残ると思いますが、それが膜移行シグナルの認識／切断を阻害するのかも、と思いました。

(無題) 削除/引用 No.2421-2 - 2013/10/03 (木) 16:56:16 - pa 分泌シグナルについてはどのようにされていますか？

P2A配列 削除/引用 No.2421-1 - 2013/10/03 (木) 16:32:46 - 大学院生 いつも勉強させて頂いています。 発現クローニングによりクローニングした遺伝子Aと遺伝子BをP2A配列で繋げたレトロウイルスを作製し、cell lineに遺伝子導入しその機能を解析しています。 発現クローニングによりクローニングしてくる時は発現していたのですが、P2A配列で繋げて遺伝子導入した場合には細胞表面に発現しません。 P2A配列で繋げるとP2Aの余分なアミノ酸が目的遺伝子に存在するため、発現が阻害されたと予想しています。(以前、既知遺伝子CとDをP2A配列で繋げた場合は細胞表面に発現せず、別々のベクターで発現させた場合は細胞表面に発現したことがあるため) 遺伝子Aと遺伝子Bの発現量を同じにしたいので、できるだけIRESではなく2A配列で発現させたいのですが、P2AではなくT2Aなどに変更したら発現するなど、解決策を知っている方が居られましたら教えて頂きたいです。

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