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(無題) 削除/引用 No.2402-8 - 2013/09/30 (月) 12:35:05 - COLOR+LIFE MPさま、Hamoniaさま、中西部ポスドクさま、AAさま。 みなさま、ご教授頂きまして本当にありがとうございます。 考え方としましては、培養細胞への毒性を考えるとCreリコンビナーゼ単体よりもCreERT2融合タンパク質のほうが、活性化されるまで核に移行することを防がれるため毒性が少ないが、遺伝子欠失の効率を考えるとCreリコンビナーゼ単体の方が良いということでよろしいでしょうか？ おっしゃるとおり、ウィルスが使えれば導入効率の心配はないのですが、残念ながら私のいる実験室では許可されておりません。 AAさまのおっしゃるように、封じ込めのグレードだと思います。 MPさまのtransientでCre-GFPを発現させGFP陽性細胞をピックアップする方法、AAさまのTet-onシステム、大変勉強になりました。 できればstableを作製したいと考えていますので、エレクトロポーションでまずはCreERT2でstableを作製し、タモキシフェンで遺伝子を飛ばす方法で行ってみようかと思います。 遺伝子欠失の効率が思わしくなければ、ご教授頂いた方法を参考に、検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.2402-7 - 2013/09/29 (日) 11:18:52 - AA ウィルスが使えないというのはおそらく実験室の封じ込めグレードの問題かと思います。 MEFだと確かにトランスフェクション効率が気になりますので、 エレクトロポレーションのほうが良いかもしれません。 皆様がおすすめされているAmaxaは評判が良いですね。 個人的な経験ではInvitrogenのNeonもかなり良かったです。 横槍になりますが、Stableで発現させるならTetOシステムはいかがでしょうか？ tTAも入れないといけないので遺伝子導入がより大変になってしまいますが、 CreERはやはり普通のCreと比較すると切れ味で劣る面もありますし、 核内移行をしなくても発現自体は普段からしてしまいます。 TetOなら必要な時だけCreを発現させるので毒性も少なそうですし、 ドキシサイクリンは溶媒が水なのでより使いやすいです。

(無題) 削除/引用 No.2402-6 - 2013/09/29 (日) 08:37:42 - 中西部ポスドク ウイルスが使えないとのことでしたが、pre-madeのCreをコードするadenovirusとかは売っていますよね。もしくはレンチウイルスとか。それだと100％の効率とか、stableを得るとかが容易ですが。 ウイルスが使えない特殊な事情があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2402-5 - 2013/09/28 (土) 09:27:22 - Harmonia うまくCre遺伝子が導入され、かつ、Creが機能すると細胞が死ぬ、という 事態を避けるためには、Cre遺伝子は入っているけどCreは機能していない 状況を作っておく必要がある。

(無題) 削除/引用 No.2402-4 - 2013/09/28 (土) 09:17:32 - MP 過剰発現Creの毒性と、loxP以外の非特異的な切断などを考慮にいれれば、stableならばCreERでタモキシフェンで飛ばす方がベターのように思います。IRESを使えばtransfection効率が悪くとも、簡単にstableはとれるはず。 transientならばCre の下流にIRES GFP などをつけたplasmid をリポフェクションし、ソーターで GFP陽性細胞をとってこればよいかと。plasmidはいずれ脱落するので、Creの毒性もそれほど気にしなくてもいい。ただMEFで効率のよいリポフェクション試薬は知りません、、、。となるとやっぱりAMAXAでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2402-3 - 2013/09/27 (金) 14:12:32 - COLOR LIFE TK-1さん、早々に教えて頂いて、ありがとうございます。 ご助言をいただけて、助かります。 �@の方法でできれば私もベストだと思うのですが、残念ながらマウスからの実験のやり直しが出来ないため、今ある樹立したMEFでの実験系を組みたいと模索しています。 �Bの方法を検討していまして、stableを作成しようと考えています。 �AはCreERを遺伝子導入した場合、タモキシフェンの添加で核にCreER蛋白を移行させる目的で必要なのかなと考えました。 外から加える際は、Cre遺伝子単独の導入で良いのでしょうか？ 重ねての質問で申し訳ないのですが、�Bのstableを作成するにあたって、ご教示頂けることがありましたら、ぜひ教えて頂きたいです。

(無題) 削除/引用 No.2402-2 - 2013/09/27 (金) 13:31:56 - TK-1 １）CreERにかけてからMEFを作り直す。 ２）なぜ外から加える際にタモキシフェン誘導が必要？ ３）stableをとらないのであれば　１００％に限りなく近いトランスフェクション効率が必要。Amaxaが一番いいかも。 その辺のことを考えれば１）がベスト。

培養細胞へのCre遺伝子導入 削除/引用 No.2402-1 - 2013/09/27 (金) 12:58:43 - COLOR LIFE ある遺伝子をノックアウトしたマウスの繊維芽細胞(MEF)を使用して機能解析を行うために、flox マウス胎児からloxP MEF 細胞を樹立しました。 次に、CRE遺伝子を導入し、目的遺伝子を欠失させたいと考えています。 この際、導入する遺伝子はタモキシフェン誘導型CRE ERT2を用い、タモキシフェン添加下での欠失を行うべきでしょうか？それとも、培養細胞からの選択マーカーの除去のようにCRE遺伝子の導入のみで欠失できますか？ また、重ねての質問になりますが、ウイルスベクターが使用できないため、lipofectamine2000やFuGENE6等のreagentsを用いたトランスフェクションを考えているのですが、推奨ベクターやreagentsがあれば、合わせてご教授頂ければ助かります。

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