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(無題) 削除/引用 No.240-11 - 2012/03/09 (金) 17:11:00 - 新人 　　 　＞AP様 　ご連絡遅れて申し訳ございません。 　いろいろ検討した結果、末端修飾なのでキットを使用してみて、 　それで様子がおかしいようであれば発注するといったことに 　なりました。 　ご親切な説明大変勉強になりました。 　どうもありがとうございました。 　＞＞協力してくださった方々へ 　さまざまな助言どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.240-10 - 2012/03/05 (月) 18:49:27 - AP 末端標識なら、やはりプライマー合成の時に末端標識をオーダーするのが、簡便、確実だと思います。自前で標識するにも、試薬やキットにお金がかかりますから、継続的に多サンプルの標識をするのでなければ、むしろ経済的ではないでしょうか。 自前で標識する場合、あくまで末端標識でないといけないか、内部標識も可がで方策もかわってきます。何に使うつもりなのかによると思いますが。 末端標識なら、簡単なのはTerminal deoxyribotransferase (TdT)を使って3'末端にいがた非依存的な標識dNTP（またはddNTP）を付ける方法です。予め、未標識のssDNAを用意してから、その3'末端に付加します。 内部標識なら、先に書いたように片側のプライマーだけでPCRして、このとき基質に標識dNTP（通常はdUTP）を入れておく方法があります。 昔は一本鎖プローブ、たとえばS1 mappingのプローブを作るのに、一本鎖DNAファージM13にクローニングし、そのDNAを鋳型にプライマーエクステンションして制限酵素消化、変性ゲル電気泳動で切り出す、なんて方法が使われていました。この方法は面倒ですけれど、アフィニティー精製によらず、精製度のたかい標識一本鎖DNAが得られます（Molecular Cloning、ひょっとしたら第二版以前に出ています）。 現在はPCR全盛の時代ですので、少々、未標識鋳型鎖が残るにしても、片側プライマーのみで一本鎖DNAを得るというのは、ファーストチョイスに近いんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.240-9 - 2012/03/04 (日) 22:26:58 - 新人 　＞AP様 　片方だけのprimerで増幅して作るといった方法を提案していただき 　ありがとうございました。 　一般的には、皆様はどうやってビオチン化した 　ssDNAを手に入れているのでしょうか？ 　注文すると、2万円近くになるため各自合成しているものと 　思っておりました。 　＞- ~様 　詳細な計算ありがとうございました。 　やはりきちんとマグネットビーズを使用した方が 　格段に効率も良いと思われます。 　ただ、手配に2週間かかると言われておりましたので、 　代替手段として行えるかどうか御教授願えればと思い 　質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.240-8 - 2012/03/03 (土) 16:01:37 - ~ メインのテーマ部分は経験が無いので傍流部分について >ストレプトアビジン固定96wellしかないのですが、 >これでも分離は可能でしょうか？ こちらのストレプトアビジンコートプレートの結合能は、 ビオチン化した分子の結合能力はおよそ13pmol/Well*。 http://www.thermoscientific.jp/lab-products/plasticware/product.php?id=474 Dynabeadsの結合能が書いてあるのはDynabeads MyOne Streptavidin T1だけのようですが、 1mg あたり1,100-1,700 pmolの遊離したビオチン、あるいは400 pmol ペプチドあるいは20 μg ビオチン化タンパク (IgG 等) を結合します。 http://www.veritastk.co.jp/cat/MOL-INV-03-0001/ 対象が違うので一概に比較できないとしてもペプチドの結合能400 pmolをつかい、ダイナビーズを1チューブあたり1mgくらい使うとすると、 同じ結合能を得るためには96ウェルプレート30ウェルくらいになります。 わざわざ30ウェルに分注するために希釈して、それぞれのウェルを洗って、回収したssDNAを濃縮するというのはかなりの手間だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.240-7 - 2012/03/02 (金) 18:17:44 - AP ビオチン化プライマーだけいれて反対側のプライマーを入れずにPCR反応（相乗的ではなく相加的な増幅ですが）するという方法では不十分ですか？ 十分量の鋳型を入れて、30サイクルくらいやれば、標識鎖と未標識の逆側鎖（鋳型として投入した物）の比率が30:1で逆側鎖の混入が3%くらいになりますが。この方法、ISHなどのための一本鎖プローブ（strand-specific probe）を内部標識で作るときもやりますが。

(無題) 削除/引用 No.240-6 - 2012/03/02 (金) 16:05:29 - in situ こんなページがあります。 参考にされてはいかがでしょうか。 http://ja.invitrogen.com/site/jp/ja/home/brands/Product-Brand/Dynal/Streptavidin-Coupled-Dynabeads/elution_of_the_streptavidin.html

(無題) 削除/引用 No.240-5 - 2012/03/02 (金) 14:15:41 - 新人 　AP様 　どうもありがとうございます。 　やはり自作のビオチンラベルのプローブの作成は 　難しいのでしょうか。 　3'にビオチンを修飾するキットもあるようなのですが、 　まわりに使用者がいないので良し悪しは分からず 　さけていました。

(無題) 削除/引用 No.240-4 - 2012/03/02 (金) 13:55:28 - AP フリーの（アビジンなどに結合していない）ビオチン化プローブを手に入れたいということですね。アビジンビーズに付けて回収したビオチン化DNAを、DNAが無傷な条件でアビジン・ビオチン複合体を引き剥がして取るのはまず無理でしょうね。 反対側のプライマーに別な標識をつけて、それに対するアフィニティーで除去するのはどうでしょう（DIGとかDNPなどで標識して抗体で捕捉するとか）。

(無題) 削除/引用 No.240-3 - 2012/03/02 (金) 13:13:30 - 新人 　 　自分で今所有しているのは、ストレプトアビジン マグネットビーズ ではなく、ストレプトアビジン固定96wellしかないのですが、 　これでも分離は可能でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.240-2 - 2012/03/02 (金) 12:56:45 - Harmonia アビジン？

ビオチン修飾したｓｓDNAの合成 削除/引用 No.240-1 - 2012/03/02 (金) 12:14:24 - 新人 　いつも大変勉強させていただいております。 　とても基本的な質問かも知れませんが、ご教授していただければ 　光栄です。よろしくお願いいたします。 　約100bpのテンプレートを、ビオチン修飾したプライマー 　でPCRして、dsDNAを合成、ビオチンがついたssDNAのみを 　回収したいのですが、ビオチンが修飾しているものと 　していないものの分別・回収はどういった方法がありますか？ 　修飾していない方の回収は、マグネットビーズとNaOHで分離する 　といった方法が書かれていたのですが・・・

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