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(無題) 削除/引用 No.2390-6 - 2013/09/24 (火) 11:49:19 - AP >そうですね。それで、発現量の高いmRNAならば末端標識プローブでも検出できるのか、というのがそもそもの疑問でした。 例えば、あるペプチドホルモンのRNAをその産生細胞のRNAから検出するとか、ribosomal proteinやhistonなど細胞一般で発現量の多いRNAを検出するとかなら出来るのではないでしょうか。 RocheのDIGシステムのハンドブック等には、末端標識オリゴプローブのアプリケーションとして、ISHとメンブレンハイブリがあげられていますね。

(無題) 削除/引用 No.2390-5 - 2013/09/24 (火) 10:41:15 - んぐ PCRプライマーの末端に３２PラベルしてからPCRして、プローブの長さを稼いだ ことならあります。

(無題) 削除/引用 No.2390-4 - 2013/09/24 (火) 10:31:55 - Atail > 簡単なことですが、プローブ一分子あたり、それがハイブリした時に標的RNA一分子あたりの標識数が異なりますね。末端ラベルだと標的一分子あたり一標識なので、発現量の少ないRNAのノーザンは苦しいです。 そうですね。それで、発現量の高いmRNAならば末端標識プローブでも検出できるのか、というのがそもそもの疑問でした。しかし高コピーmRNAとは言ってもsnRNAなどのabundantな短いRNAとは比にならない発現量だと思うので、やはり末端ラベルは厳しいですかね。 > なんとなくですが、DIGとRIの感度の差の議論になりそうですね。 > 以前、RIは時間さえおけば必ず検出できるという先生が > 身近にいましたが実際どうなんでしょうか？ と言いつつも、いま実際32Pラベルを使っているので、なんだか望みもありそうです。プローブ量は多めにして、試してみます。

(無題) 削除/引用 No.2390-3 - 2013/09/24 (火) 04:04:11 - AA なんとなくですが、DIGとRIの感度の差の議論になりそうですね。 以前、RIは時間さえおけば必ず検出できるという先生が 身近にいましたが実際どうなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2390-2 - 2013/09/24 (火) 00:15:25 - AP 簡単なことですが、プローブ一分子あたり、それがハイブリした時に標的RNA一分子あたりの標識数が異なりますね。末端ラベルだと標的一分子あたり一標識なので、発現量の少ないRNAのノーザンは苦しいです。

ノザンのプローブ、末端ラベル vs PCR 削除/引用 No.2390-1 - 2013/09/23 (月) 23:33:09 - Atail ノザン用プローブとして、20-50nt程度のオリゴDNAの末端に32PやDIGなどをつけたものを使う場合と、PCRでプローブを作り標識物質をこれに取り込ませて調製する場合がありますが、どのように使い分けていますか？ 当方のこれまでの経験では、短いRNAの検出にはオリゴDNAを、mRNAの検出にはPCRで作成したプローブを使っておりました。いま、UTR含め2000nt程度の長さのmRNAを検出したいのですが、手元には末端ラベルキットしかありません。ひとまず末端ラベルの短いプローブで試してみるつもりですが、今後のために成功例、失敗例などを、プローブの種類に加えターゲット長や発現レベルの情報とともにお聞かせ頂ければと思います。よろしくお願い致します。

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