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(無題) 削除/引用 No.2388-12 - 2013/09/23 (月) 11:00:42 - 中西部ポスドク なるほど、同種抗体のブロッキングはよいアイディアかもしれません。ただその後ラビットの一次抗体を使った後の検出がなかなか大変そうですね。たしかにHRPをつけるのもひとつですが、、、。

(無題) 削除/引用 No.2388-11 - 2013/09/23 (月) 09:43:52 - AP Fc領域が抗原抗体反応に因らない結合(例えばFc領域がヒスチジンリッチであることから、配位結合や負に帯電するタンパク質などに対する静電気結合）をするタンパク質がいろいろあるので、そのせいかもしれません。 ・二次抗体由来動物の正常血清でブロッキングする ・F(ab')2抗体、Fab断片抗体を使う

(無題) 削除/引用 No.2388-10 - 2013/09/23 (月) 02:52:15 - おお 何とかブロックできないもんでしょうかねぇ、、、たとえばその目的に対する抗体を直接HRPとかでらべるして(びおちんでもいいかな)、neutral な同種(ラビットですよね)の抗体をブロッキング剤にまぜて、ブロッキング、抗体とインキュベーションをしてみるとか。非特異な抗体の吸着はラベルされてない抗体でオキュパイされればそのシグナルは抑制できますので。 原因がわからないだけにちょっとワークするかわかりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.2388-9 - 2013/09/22 (日) 14:04:14 - 中西部ポスドク 皆様coIPの話を出してしまったので、わかりにくかったようで申し訳ありません。 問題となっているのは蛋白Xを高発現させたlysateがどの抗体でもモノマーとダイマーの位置にバンドが検出されてしまう点です。FLAG抗体を用いて、Xと結合すると予想されたY(50kDa)とのcoIP実験を行い、Y抗体で検出したところX高発現レーンのみで50kDaのバンドが出たため、結合が陽性かと思ったのですが実際には高発現したXにY抗体がクロスリアクトしたのではないかと思っています。いくつか試したその他の抗体、抗GFP抗体などですら陽性のバンドが出てしまうので、抗体と結合しやすい性質があるのではないかと疑っています。高発現しすぎている可能性は否定はできないのですが、内在性の数倍程度なのでそこが問題ではないと思っています。FLAG抗体はマウス、Y抗体はラビットですが、念のためにIgG-HC/LCの可能性を否定する為にTrueblotでの検出なども試してみましたが、特に変化はありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2388-8 - 2013/09/22 (日) 05:14:36 - おお 確信はないのですが、思いついたことをかいてます。

(無題) 削除/引用 No.2388-7 - 2013/09/22 (日) 05:13:22 - おお >当初50kDaの内在性の標的蛋白が落ちて来た この蛋白でIPしてflagで検出してみましたか? ヘモグロビンのヘムが大量にあると擬陽性のシグナルがでるらしいけど、通常の培養のけっせいからの持ち込みできになったことはありません。 あとはいろんな抗体でノンスペを拾いそうなものとして、ケラチンなどがあげられます。動物が抗原に含まれるコンタミれべるのケラチンからターゲットと同時にケラチンにたいするこうたいもつくってしまうようです。 精製後もそれを引きずっている可能性もありますし、ケラチンは最もコンタミしやすい蛋白です(MSでどんだけ厳重にやってもでてくるぐらい). モノクロをつかうと解決することがたいていです。あとは使う抗体を吸収かけるか。。。 あとはFcリセプターが大量にあるとそれに抗体が引っかかるというのはあるかもしれませんが、、、

(無題) 削除/引用 No.2388-6 - 2013/09/21 (土) 15:13:35 - 名無し 実験の詳細わからないのでなんだが、coIPということなので、抗体でとってきてるのかな。IPで50KDaくらいで2次抗体と反応するなら、うちら的にはIgGのH鎖との反応をまず疑うとおもう。2次抗体だけで反応させてみれば容易に分かる。ウェスタンでL鎖特異的な抗IgG抗体使えば解決するのでは。 もちろんIgGとXがおなじ分子量位置に重なっていることもあり得るんだが、これもL鎖特異的な抗IgG抗体なら判別できる。

(無題) 削除/引用 No.2388-5 - 2013/09/21 (土) 14:04:05 - 中西部ポスドク ttt様 高発現した、というのはLipofectAmine2000を使ってプラスミドを一過性に高発現しています。この蛋白は細胞内オルガネラの膜に局在することが報告されています。 二次抗体としてはCell signalingのHRP-anti-rabbit IgGを使っています。今まで特に問題となることはありませんでした。血清蛋白は細胞をPBSで洗浄することでかなり除去できていると思っていますし、高発現細胞のみで見られるので、血清由来というよりは高発現した蛋白の一次構造そのものがラビット由来抗体とaffinityがあるのではと疑っています。今まで経験したことがない事態でしたので相談させて頂きました。

(無題) 削除/引用 No.2388-4 - 2013/09/21 (土) 12:17:10 - ttt 高発現したものと言うのはtransfectionしたものということでしょうか？そうでないのでは見られないのでしょうか？ 個人的な経験では、「普通の」抗ラビットの二次抗体は結構非特異性が強いものが多くて、特にlysosomeの機能が悪い可能性のある細胞で強かった、ということがあります。「他の種の血清由来のタンパクへの交差反応性が低い」と表示されてる抗ラビット二次抗体に変えたら綺麗に消えたので、正式に同定はしてませんが、FBS中の血清蛋白だった可能性があると思っています。 もしトランスフェクションした細胞のみで見られるとしたら、トランスフェクション試薬の中にはプロトンスポンジ効果などでlysosomeの機能を阻害するものもあるようなので、もしかしたら関係してるのかも知れない、と思いました。 　 もっとも、もし既にそういう非特異の低い二次抗体を使ってるとしたらこの可能性は極めて低いと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2388-3 - 2013/09/21 (土) 11:39:39 - 中西部ポスドク ttt様 免疫沈降でもそうなのですが、通常のダイレクトWBでも高発現したレーンにのみ予想サイズのシグナルを全く関係のない抗体で検出しております。二次抗体単独のネガコンは見ておりません。

(無題) 削除/引用 No.2388-2 - 2013/09/21 (土) 08:42:25 - ttt Igの重鎖・軽鎖の可能性は否定してますか？ 抗ラビットの2次抗体は他の種由来の血清蛋白への特異性が低いものでしょうか？　2次抗体単独のネガコンは見てますか？

WBでの非特異的吸着 削除/引用 No.2388-1 - 2013/09/21 (土) 07:25:57 - 中西部ポスドク いつもお世話になっております。 現在とある膜貫通蛋白XにFLAGタグをつけたものを用いてcoIPの実験を行っています。 この分子は2−30kDaのモノマーと40-60kDaのダイマー（SDS-PAGEでも壊れない）を作ることがしられています。 当初50kDaの内在性の標的蛋白が落ちて来た、と喜んでいたところ、どうもその内在性分子に対するラビットの一次抗体が高発現したXdimerを認識していたようです。というのも、無関係と思われる分子に対するラビット抗体で染色しても同じ位置にシグナルが出るのです。また、通常のウエスタンブロットでXと無関係の分子を染めた際もモノマー／ダイマーの位置に高発現させたレーンでのみシグナルを観察しております。これではどんな分子とも共沈しているように見えてしまいますが、実際にはそうでないと思います。 SDS-PAGE後なので、ある程度蛋白の高次構造は破壊されていると思うのですが、配列的にラビットIgGと結合しやすいなど、もしそういう例をご存知の方は教えて頂けますと幸いです。

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