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(無題) 削除/引用 No.2371-14 - 2013/09/17 (火) 08:36:36 - 波平 ＞付加する配列はcleavageを基準にどの程度の余裕が必要でしょうか？ 　基本的に，分泌タンパク質なので高次構造形成によるシグナルペプチドの未切断はあまり考えられないような気がしますが。これならば，本来のT. reeseiでも切断されないような気がしますが。切断部位の配列が少なからず切断効率に影響を及ぼしますが。 　それよりもどのような経緯でうまく分泌されていないと判断されたのが気に掛かります。活性それともタンパク質を濃縮してSDS-PAGEで確認したのかなど。 ＞ゴルジ体で決められる輸送経路などにもこのシグナルペプチドが関係しますか？（ゴルジ用のシグナルなどはあるのでしょうか？） 　分泌シグナルがあれば基本的には細胞外に分泌されます，ゴルジやERや細胞膜に局在するにはそれぞれの局在化シグナルなるが必要だと思います。 >元のT. reesei由来シグナル配列の除去は必要でしょうか？（そのままN末に付加してしまって問題ないでしょうか？） 除去が必要です。 ＞一般的に使用されている分泌シグナル配列などはありますか？ 一般的にはS.cerevisieaのプレもしくはプレプロαファクターが真菌では一般的ですが，ケカビは知りませんが，クモノスカビのR. oryzaeのリパーゼやアミラーゼなどの分泌シグナルなんかは使えないかな。やってみないとわからないけれども。もっともゲノムが開いていれば，いろいろ遊べそうですが。 老婆心ながら，目的を見失わないように実験デザインした方がいいような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2371-13 - 2013/09/16 (月) 19:32:20 - 心太 > ちなみに、シグナル配列は普通は疎水性で、付けたままだとタンパクの性質に影響する可能性があるので、個人的にはタンデムにしないで1つだけで元のものは除去するのが良いと思います。 そうですよね。元あった方も膜貫通性を保持していたらタンデムで２回貫通してしまいまうんじゃないかと心配していたのです。 > 目的種においてシグナルペプチドが切れないと分泌されないので、切断部位付近を長めに取って目的種の分泌の系にあわせる配慮がいるかも。 シグナルペプチドが切れていないことが一番疑わしく思いました。シグナル配列はスワッピングしてみます。酵素の活性さえ見られれば大丈夫だと思いますので。 皆様、多くのご助言ありがとうございます。 まずケカビのネイティブな分泌タンパクを幾つか当たって、導入遺伝子における過剰分泌系を確認いたします。 シグナルペプチド配列については長めにスワップして組換えます。 それで分泌が確認できず、細胞内活性が確認された場合はRFPなどで輸送や局在を調査します。また、糖修飾についても追いかけたいと思います。 リテンションシグナルについては解かり次第、酵素配列修飾の参考にしたいと思います。 大変参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.2371-12 - 2013/09/16 (月) 19:15:48 - 心太 tttさん、おおさん、ふつうにさん ご返答ありがとうございます。 > クォリティコントロールでERレベルで排除されてるかもしれないし、安定化させるコファクターや翻訳後修飾が存在しないので不安定で直ぐに分解されるのかも知れない。 なるほど。作り慣れていない物を作りすぎる過程で不具合が起きるということですね。確かに強力なプロモーター配列を用いていますので、逆にリプレスが起きているのかもしれません。プロモーターを弱くしたりシャペロンの同時導入も検討してみます。 > ゴルジ、ER、lysosomeなどにとどまる、移行するものは一般的にはりテンションシグナルがあるといいますので、そういうのがないやつが分泌するのかなぁと漠然と思ったりしています。 シグナルペプチドが切れた後のN末端、あるいはC末端でしょうか。いずれにしてもリテンションシグナルなるものの情報はありがたいです。調べてみます。 > 糖修飾も輸送と関係があるようなので、そう言うのも見ていかなくてはいけないかもしれませんね。 > 分泌させるのが目的ということなので、メカニズムは二の次かもしれませんが、メカニズムにかんしても何か言えれば面白いとおもいました。いがいと知られてないことの発見につながるかもしれません。 糖鎖修飾についてもまだ手掛けていませんので、そういうことになると結構骨が折れそうですね。でも新しい発見になればそれも楽しそうです。検討します。

(無題) 削除/引用 No.2371-11 - 2013/09/16 (月) 06:41:27 - おお ああ、シグナルペプチドがきれていないっていうのはありえそうですねぇ。

(無題) 削除/引用 No.2371-10 - 2013/09/16 (月) 06:19:41 - ふつうに >[Re:8] tttさんは書きました : > ちなみに、シグナル配列は普通は疎水性で、付けたままだとタンパクの性質に影響する可能性があるので、個人的にはタンデムにしないで1つだけで元のものは除去するのが良いと思います。というか、タンデムにするということはやったことも聞いたこともないのでどういう影響があるか予想できないので。 この方の言われる通りです。 目的種においてシグナルペプチドが切れないと分泌されないので、切断部位付近を長めに取って目的種の分泌の系にあわせる配慮がいるかも。余計なペプチドがついてしまうことがありますが。 もし、それでもダメなら、種特異的な、蛋白特異的な制限があると私なら考えます。

(無題) 削除/引用 No.2371-9 - 2013/09/15 (日) 15:31:07 - おお T. reeseiとケカビで分泌制御が若干違うかもしれませんね。ゴルジ、ER、lysosomeなどにとどまる、移行するものは一般的にはりテンションシグナルがあるといいますので、そういうのがないやつが分泌するのかなぁと漠然と思ったりしています。 そのたんぱくは、けかびでは偶然ある配列がりてんしょんシグナルとして認識されてしまうんでしょうかとか、あとは糖修飾も輸送と関係があるようなので、そう言うのも見ていかなくてはいけないかもしれませんね。 分泌させるのが目的ということなので、メカニズムは二の次かもしれませんが、メカニズムにかんしても何か言えれば面白いとおもいました。いがいと知られてないことの発見につながるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2371-8 - 2013/09/14 (土) 23:51:46 - ttt ちなみに、シグナル配列は普通は疎水性で、付けたままだとタンパクの性質に影響する可能性があるので、個人的にはタンデムにしないで1つだけで元のものは除去するのが良いと思います。というか、タンデムにするということはやったことも聞いたこともないのでどういう影響があるか予想できないので。 シグナル配列はモノによってER移行効率に差があると言われていますが、全く分泌されないとかそういう極端なものは無いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2371-7 - 2013/09/14 (土) 23:47:07 - ttt 現在のトランスフェクションの系で確実に分泌されるタンパクはコントロールとして必須でしょうね。 トランスフェクション効率の問題もあるかも知れないし、逆に過剰発現とかでアグってクォリティコントロールでERレベルで排除されてるかもしれないし、あるいは（ホモログが無いということで）安定化させるコファクターや翻訳後修飾が存在しないので不安定で直ぐに分解されるのかも知れない。 少なくとも、「実験系」の問題なのか、タンパク固有の問題なのかは明確にしておく必要があると思います。

(無題) 削除/引用 No.2371-6 - 2013/09/14 (土) 20:19:39 - 心太 Harmoniaさん > ケカビの分泌タンパク質の遺伝子をケカビに導入して、分泌される実績は > お持ちでしょうか？ 残念ながら私の用いている種ではそういった実績はありません。 それを含めてセクレトームで明らかにしていくつもりです。 しかしなるほど。ありがとうございます。 設計は分泌タンパクで実践してからに致します。 配列はやはりスワッピングした方がよいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2371-5 - 2013/09/14 (土) 19:50:37 - Harmonia ＞・一般的に使用されている分泌シグナル配列などはありますか？ ケカビの分泌タンパク質の遺伝子をケカビに導入して、分泌される実績は お持ちでしょうか？あるなら、コード領域を単純にスワップすればいける 気がします。論理ではなく実践主導になるのですが。

(無題) 削除/引用 No.2371-4 - 2013/09/14 (土) 17:56:11 - 心太 おおさん 早速のお答えありがとうございます。 > ペプチドをつける前に、ゴルジ、 ERでリテンションがかかってないかとか、エンドソームまで行くが分泌へいかず、細胞ないにとどまってるとか、そのへんは見ないでいいんでしょうか。 説明および考えが不足していて申し訳ありません。 ゴルジまたはエンドソームに留まっている可能性も考え、分泌に向かうような培養条件等を検討しております。また、当該酵素のC末にRFPを融合させて輸送や局在の追跡も考えています。 ですが、いずれにせよ現在の培養条件を大きく変化させずに分泌されないと目的を達成できないので、効率良く分泌されるような系を確立したいのです。 そこでセクレトームを介して効率的な分泌ペプチドを推定し、付加させようと考えております。

(無題) 削除/引用 No.2371-3 - 2013/09/14 (土) 15:23:18 - おお >[Re:1] 心太さんは書きました : > ・ゴルジ体で決められる輸送経路などにもこのシグナルペプチドが関係しますか？（ゴルジ用のシグナルなどはあるのでしょうか？） わかっている範囲においては、シグナルペプチドはERのサイトゾル側で合成時に切り離されるので、その後のゴルジのりテンションに使われることはありません。 You might want to refer to http://cshperspectives.cshlp.org/content/3/8/a005264.full

(無題) 削除/引用 No.2371-2 - 2013/09/14 (土) 14:29:03 - おお ペプチドをつける前に、ゴルジ、 ERでリテンションがかかってないかとか、エンドソームまで行くが分泌へいかず、細胞ないにとどまってるとか、そのへんは見ないでいいんでしょうか。

分泌シグナル配列を組換えタンパクに付加しようと思うのですが 削除/引用 No.2371-1 - 2013/09/14 (土) 13:43:14 - 心太 お世話になっております。 T. reesei由来の分泌酵素を他生物であるケカビに導入して異種発現を試みているのですが、うまく分泌されません。 ・当該酵素の予想アミノ酸配列 N末端にシグナルペプチドが推定できます。 ・導入した遺伝子はケカビ用にコドン頻度を修正しています。 ・導入株の細胞ライセートからはこの酵素の活性が確認できました（元々ホモログ等を有していません）。 ・T. reeseiにおいて細胞外壁（膜）に吸着するということはなく、細胞外に完全に分泌されることが分かっています。 これらのことから導入遺伝子の翻訳までは問題なく、T. reesei由来のシグナルペプチド配列がケカビで働いていないのではと考えました。 そこで、ケカビの分泌タンパク由来の推定的シグナルペプチドをN末端側に付加しようと思っているのですが・・・・・・ ・付加する配列はcleavageを基準にどの程度の余裕が必要でしょうか？ ・ゴルジ体で決められる輸送経路などにもこのシグナルペプチドが関係しますか？（ゴルジ用のシグナルなどはあるのでしょうか？） ・元のT. reesei由来シグナル配列の除去は必要でしょうか？（そのままN末に付加してしまって問題ないでしょうか？） ・一般的に使用されている分泌シグナル配列などはありますか？ 質問が多くて申し訳ありませんが、何卒皆様のお知恵をお貸しください。 （よろしければ参考文献もご紹介ください）

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