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簡単な結果の報告 削除/引用 No.2354-10 - 2014/01/06 (月) 14:58:33 - サンショウウオ Bodipy　FLを使用したところ、非特異吸着が全くなかったが（理想的なほどに非特異吸着がなかった）、褪色がひどく何とか画像が取れる。 CF488A　Alexaに比べ割りと非特異吸着が少し抑えられ、光に対してかなり安定であった。 　どちらも一長一短といったところでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2354-9 - 2013/09/24 (火) 07:42:40 - サンショウウオ どうも、久しぶりに除いてみたら返信があったので。 今回、proteinさんが勧めてくださったImage-it FX signal enhancerですが、上司に購入許可をもらえなかったため試すことができそうにありません。 CF488Aのその後ですが、日本から注文した場合、現時点で輸入実績が無いため到着まで時間がかかるようです。

もう解決かもしれませんが 削除/引用 No.2354-8 - 2013/09/13 (金) 03:04:55 - protein invitrogenから Image-it FX signal enhancer http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/I36933 というものが売られていて、Alexaの電荷による非特異的結合を減らすと謳っています。 私は使ったことがないのですがお試しになってはいかがでしょう。 というか、私自身がこの商品に興味があるので 使った方がおられましたら感想を教えていただければ嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.2354-7 - 2013/09/12 (木) 21:04:28 - サンショウウオ たくさんの回答ありがとうございました。 　今まで合成したプローブだけの非特異吸着しか考えておらず、色素単体でどれだけ細胞膜に吸着するかを試してみたいとおもいます。（多分NHS基とかの処理がいるかもしれません。） 　確かに、CF488Aのカタログ（http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/cf_dyes_selection_guide.Par.0001.File.tmp/cf_dyes_selection_guide.pdf）の横の方に、 ＞「AF488に比べ最小限の電荷を持つため抗体の非特異吸着を減らせる」 とあるので極性基による相互作用で非特異吸着していることもあるようですね。極性アミノ酸増やしてプローブの親水性を上げれば非特異が減ると思っていました。ORZ 　重ね重ね、ご指導いただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2354-6 - 2013/09/12 (木) 00:40:27 - furai Alexaは硫酸基が効いてるので、疎水性よりはイオン的な非特異的結合のほうが強いと言われているような。確か、硫酸基のないCF488Aの宣伝文句にそんなのがあったと思います。経験ではノンスペはほとんど一次抗体の問題。というか、2次抗体だけでどの程度染まるか確認しました？

(無題) 削除/引用 No.2354-5 - 2013/09/11 (水) 23:19:49 - ttt ちなみに、個人的にはAlexaFluor488はかなり親水性だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2354-4 - 2013/09/11 (水) 23:18:26 - ttt protein-transduction配列、例えばTAT、みたいなpositive chargeが沢山あるものでは細胞表面のsulfated glycanみたいなものに結合する可能性はありますかね。 と言うか、コントロールには試薬と同じかそれ以上の濃度の非修飾Alexaで処理した細胞を使うのが適切な気がしますが。そうすれば、同時に、Alexa部分が原因かわかりますよね。

(無題) 削除/引用 No.2354-3 - 2013/09/11 (水) 23:04:55 - サンショウウオ 極性アミノ酸を半分ほど含むペプチドに色素を修飾しているので、それは細胞膜には局在しないというふうに考えているため、蛍光色素の疎水性が非特異吸着の原因だと考えました。

(無題) 削除/引用 No.2354-2 - 2013/09/11 (水) 21:18:33 - ttt 疎水性による非特異吸着と考える根拠は何ですか？ 官能基とか脂肪鎖が付いてるんですよね？　ソッチの方の非特異性の可能性はありませんか？

Alexaの非特異吸着 削除/引用 No.2354-1 - 2013/09/11 (水) 16:56:18 - サンショウウオ 今、実験でAlexaFluor488を修飾したプローブを使用しているのですが目的のオルガネラが染色されず、ネガティブコントロールのサンプルでも細胞膜に蛍光が観察されてしまい、Alexaそのものの非特異吸着を疑っています。 　そこで、研究室の人からBodipy系列の色素のほうが親水性が高く非特異吸着も減らせるのではないかと言われて検討しているのですが、分子構造を見る限りどちらも疎水性が高そうでBodipyを使ってみようか迷っています。 　画像は、染色前の細胞画像を撮影してバックグラウンドがない程度の励起光強度を確認してから撮っています。 　AlexaやBodipy系列の色素の親水性に関して知識のある方。教えていただければ幸いです。よろしくお願いします。

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