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(無題) 削除/引用 No.2343-13 - 2013/09/04 (水) 18:43:35 - フローサイトメトリー 同じ集団の個々の細胞を１個、１個、見ない限り、わかりません。 標準的にはフローサイトメトリーを使います。 または、動物細胞などで、個々の細胞を、M期の染色して、１個、１個、見て観察できる場合は、たとえば、、、１００個のうち５個がM期ならば、５％M期となります。 M期特異的なmRNAが比較的多いから、この細胞はM期にある、、、というような判断は普通しません。

(無題) 削除/引用 No.2343-12 - 2013/09/04 (水) 12:39:53 - おお >[Re:8] 焼きサバ定食食べたいさんは書きました : > 皆様、ご指導ありがとうございます。 > > 皆様のご指摘の通り、絶対定量が必要だと考えています。 誰か絶対定量が必要っていってたっけ?絶対定量の定義を間違えているだけかな、、、 > > 細胞周期が回っている細胞、および休止期になるよう > 薬剤で細胞周期を無理やり止めた細胞等のコントロールと比較するよう > 指示をしておきたいと思います。 > 発現が高いまたは上がるといいたいときには、発現が上がっていないものが最低限コントロールとして必要です。まあ上がっているコントロールもあればそれはそれでいいでしょうけど。 それより、G0を証明する実験が必要なのではないでしょうか?DNA合成がおきていない。細胞あたり2nのDNA量である。cdk2などが活性化していない(リン酸かフォームや実際の活性測定で)、cdk inhibitorの蛋白レベルでの発現が上昇しているなど。

(無題) 削除/引用 No.2343-11 - 2013/09/04 (水) 10:04:56 - ~ とりあえずPIやヘキストで染めてフローサイトメトリーにかければ、 M期で止まっているかどうかは結論付けられますよね。 M期特異的遺伝子の発現量を示すよりも明確に結論付けられるでしょう。 発現量が適切なコントロールと比較しても高かいことを前提として、 使用されている細胞について、調べたG0期特異的遺伝子やその他の細胞周期特異的遺伝子の発現機序はどの位わかっているのでしょうか？ 各遺伝子の発現の特異性に頼ることになりますよね。 当該遺伝子が高発現ということは細胞がこういう状態になっているのでG0期に入っていると言える、くらいは言えるデータがあるのでしょうか？ 「G0期の細胞とセルサイクルの回っている細胞の比較で高発現だった遺伝子」、の解析では、今回の実験操作により当該遺伝子発現が向上した可能性を否定できませんよね。

(無題) 削除/引用 No.2343-10 - 2013/09/04 (水) 09:44:37 - qq G0-arrestが全細胞に起きているのであれば、他の細胞周期のマーカーは激減しているだろうから、コントロールさえとれば問題は発生しそうにないですね。 おそらく一部の細胞がG0-arrestしていると言いたいのかなと思うのですが、そうであれば、FACSか細胞染色で解析する必要があるように思います。 分化誘導はG0-arrestと区別できんのかねぇ。G0も一種の分化誘導と言えそうです。

(無題) 削除/引用 No.2343-8 - 2013/09/04 (水) 09:37:18 - 焼きサバ定食食べたい 皆様、ご指導ありがとうございます。 皆様のご指摘の通り、絶対定量が必要だと考えています。 細胞周期が回っている細胞、および休止期になるよう 薬剤で細胞周期を無理やり止めた細胞等のコントロールと比較するよう 指示をしておきたいと思います。 私の研究方針の指示の仕方が曖昧だったため、 このようなことになってしまったと反省している所存でございます。 ありがとうございました。 ちなみに暗証を入れ忘れてました（←すいません）。

(無題) 削除/引用 No.2343-7 - 2013/09/04 (水) 09:00:09 - 774 >「ある細胞内のG0期、G1期、S期、M期特異的遺伝子の >発現量を定量PCR法を用いて比較解析を行ったところ >同一細胞内において、G0期特異的遺伝子の発現が >他の遺伝子に比べ高いため、 >この細胞はG0期でcell cycle arrestを起こしている。」 皆さんの指摘にあるように、 この中の”他の遺伝子に比べ高いため”が間違っていて、 ”コントロールの細胞と比べて高いため”となるべきだと思います。 G０arrestをサポートするデータとのことですので、 mRNAレベルでもギリギリセーフかな。という気もしますが、 どうでしょう？ コントロールの細胞は、このG0arrestが、 何かの処置をすることおきるのか？ 何もしないでG０期にいるのか？で変わるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2343-6 - 2013/09/04 (水) 08:38:03 - Harmonia 「G0期特異的遺伝子の発現を調べたところ、その遺伝子のG0期での発現が G1期、S期、M期に比べ高いため、G0期でcell cycle arrestを起こしている」 であれば、「G0期特異的遺伝子」をマーカーとして使ったと理解できます。 「ある細胞内のG0期、G1期、S期、M期特異的遺伝子の 発現量を定量PCR法を用いて比較解析を行ったところ 同一細胞内において、G0期特異的遺伝子の発現が 他の遺伝子に比べ高いため」 に続くべき結論は、 「この細胞はG0期でcell cycle arrestを起こしている」 ではないと思います。 それではなにが適切かというと、これぞということは思いつきませんが、 「G0期特異的遺伝子はG1期、S期、M期特異的遺伝子の発現に影響を与える 可能性がある」 なら、許容範囲でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2343-5 - 2013/09/04 (水) 00:31:43 - おお RTの効率など考えると発現の比を見ているとは思えませんよね。あと増幅効率はチェックしてますか? セルサイクルが回っている細胞などと比べて多いという方が説得力があると思います。 抗体間で検出感度も違うのでタンパク間の比較をするなら、両方のスタンダードが必要かと思います。

(無題) 削除/引用 No.2343-4 - 2013/09/04 (水) 00:17:19 - 独り言 言えると思えません。絶対量を求めないと。 そもそも細胞周期関連の遺伝子はタンパク質分解で調節されていることが多いので、タンパク質を見ないと意味がないと思います。 タンパク質で見ることがkey pointだと思います。 > 後輩は > 「そんなことを言ったら、ウエスタンブロット法だって各蛋白質 > に対する抗体の引っ付き具合が必ずしも同一ではないから > 発現量差の比較はできないではないか」 > みたいなことを言っています。 > どのような実験のことを指しているのかわかりませんが、単なる細胞ライセートのウエスタンブロットで異なるタンパク質の発現量の比較をしているのですか。 濃度存知のそれぞれの精製タンパク質を同時にブロットして濃度を求めないと発現量の比較はできません。

(無題) 削除/引用 No.2343-3 - 2013/09/03 (火) 23:37:19 - 直輝 G0期特異的遺伝子のCt値：23 G1期、S期、M期特異的遺伝子のCt値：35 これぐらいだったら、信じますけど。 その細胞を他の細胞周期で停止させたサンプルと比較できないんでしょうか？ 定量的PCRにしろ、ウェスタンにしろ。

定量PCRによる同一細胞内別遺伝子の発現比較 削除/引用 No.2343-1 - 2013/09/03 (火) 23:13:58 - 焼きサバ定食食べたい すいません、皆様のお力をお借りさせてください。 細胞周期停止がkey pointである研究において 彼（後輩）の細胞周期解析結果を補佐する実験を指示したら、 以下のような実験を行ってきました。。。 「ある細胞内のG0期、G1期、S期、M期特異的遺伝子の 発現量を定量PCR法を用いて比較解析を行ったところ 同一細胞内において、G0期特異的遺伝子の発現が 他の遺伝子に比べ高いため、 この細胞はG0期でcell cycle arrestを起こしている。」 こんなことは言えないですよね。。。 各遺伝子に対するプライマーの増幅効率が異なるため、 正しく細胞内各遺伝子量の比を示しているわけではないと思うのですが、、、 後輩は 「そんなことを言ったら、ウエスタンブロット法だって各蛋白質 に対する抗体の引っ付き具合が必ずしも同一ではないから 発現量差の比較はできないではないか」 みたいなことを言っています。 いかがでしょうか。

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