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(無題) 削除/引用 No.2341-5 - 2013/09/05 (木) 02:51:53 - 名無し 分子量いくつよ。IgG関係のバンド以外にもビーズによってはprotein G由来のバンドが反応することもあるよ。これ架橋してる関係でスメアになったり分子量がまちまちで複数出る事もある。それ2次抗体だけでは反応しないかな。 もしか、その蛋白質がprotein Gとかimmunoglobulin自体に親和性あるかもしれない。 あとコンタミナント減らす方法だけど、自己流だけどいくつか書くとく。ただあくまで一般的な話だから。SDS sample bufferで直接溶出すると要るものだけでなく、要らないものもたくさん混じってくるわけで（洗剤でビーズ洗った洗浄廃液みたいなもんだし）。もちろん磁気ビーズだとセファロースとかよりはかなりましだけど。欲しいものがバックグラウンドと区別できるくらい十分な量回収出来れば大きな問題にはならないけど、微量だとコンタミナントに埋まってうまくいかないな。 pH2.3くらいとか、pH9以上とかで溶出すると抗体が変性して抗原分子は解離するけど、コンタミナントはあまり洗い出されないんでコンタミある程度までは減るらせるよ。　 あと塩濃度は低過ぎると非特異的吸着は確実に増える。あとプレクリンの有効性はかなり疑問もってる。それと各種界面活性剤の検討もしたけど、なんだかなーみたいな感じだった。ていうか強すぎると抗原抗体反応や複合体安定性に逆効果だし。洗浄回数も３回洗って変わらなければ、たぶんそれ以上やってもあんまりーーーって言う感じだった。

(無題) 削除/引用 No.2341-4 - 2013/09/04 (水) 04:11:00 - モモ >サンプルのタンパク量の問題でしょうか？バッファーの洗いの問題でしょうか？ こういう点に関して何の情報も出さずに第三者に聞いてもしょうがないでしょう？

(無題) 削除/引用 No.2341-3 - 2013/09/04 (水) 02:18:30 - おお しつこくゲルに残るタンパクはありますね。 まずはIPやwashのバッファーのstringencyを上げるということが考えられます。RIPA buffer というのがあります1%Triton-100(or NP-40) 0.1-1% deoxycholate, 0.1%SDSというデタージェントが入っていて可也ノンスペは落ちます。ただし、タンパク相互作用の一部もはがしてしまう可能性はあります。 その他各種界面活性剤やその組み合わせは可能性がありますが、こうするといいという一般的な道筋はたてにくく、アウトプットが保障される訳ではないので、難しいところです。 あと塩濃度を上げるとイオン相互作用をメインとするノンスペは落ちるといわれますが、それが効果的かどうかはやってみないとわからないです。 もしIPしてきて、そのinteractorのノンスペが解消できないなら、逆にそのinteractorでIPした方がスッキリするかもしれません。IPによりノンスペと特異的な吸着に10倍とか理想的にはもっと差あるなら、特異的なinteractionはみやすいですから。 あとビーズのキャパシティーを１度確認してください10ulもあれば検出に十分以上のタンパクが回収できることが分かるかと思います。ゲルを最小限にすることもある意味ノンスペを抑えるコツです。 IPの時間でもノンスペを減らすことは可能かと思いますのでO/Nでやっているなら2時間とか比較的短い時間でやってみるのも選択肢かと また指摘がありますが、ノンスペを拾っているだけで相互作用はネガティブではないかという指摘にも耳を傾けるべきかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2341-2 - 2013/09/03 (火) 23:29:58 - 直輝 ・洗いが足りない ・実験サンプルもネガコン並にしかくっついてない ポジコンに比べれば微かだけど、ネガコンにもわずかなバンドが出ることはあります。たぶん吸着によるもので、生物学的に意味のある結合ではないと考えてます。

免疫沈降におけるNormal IgG 削除/引用 No.2341-1 - 2013/09/03 (火) 19:58:45 - IP 免疫沈降をプロテインGの磁気ビーズでやっています。 IP、WBともにラビットポリクロで、そのネガコンはノーマルのラビットIgGでやっています。 直接法、間接法どちらも試しても、ノーマルIgGにも標的タンパクのバンドが出てしまいます。 バンドは重・軽鎖ではなく標的と同じ大きさで、IPの前にプレクリアは行っています。 ノーマルIgGにもバンドが出てしまう原因として何が考えられるでしょうか？ サンプルのタンパク量の問題でしょうか？バッファーの洗いの問題でしょうか？ 何でも良いので、なにかアドバイスをもらえると有り難いです。 よろしくおねがいします。

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