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(無題) 削除/引用 No.2334-21 - 2013/11/04 (月) 01:38:22 - おん 私はDB3.1とccdb survivalを使ったことが無いのですが 知人が以前言っていたのは、invitrogenに尋ねてもできればDB3.1株で実験してほしいと言われたそうです。テクニカルサポートで対応してくれる人も数人いるようですし個人の感覚でアドバイスもくれると思いますが、性能はDB3.1の方が圧倒的に良いイメージです。 コンピを分けてくれるラボがあればいいのですが、そうでないから現状としてccdb survivalを買わざるをえないのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2334-20 - 2013/11/02 (土) 22:31:09 - pa 以前いたラボではDestベクターの改変がよくやられてましたが、ccdBだからというトラブルは聞いた記憶がないのです。なので、基本的にはいつもどおりの操作で問題無いと考えています。ただそのときはDB3.1株を使っていました。ccdb survival株の使用感は私も使われてる方の感想を知りたいです。私がそういう状況で対応するとしたらやはりDNAの量を増やすか、培養時間を長くとるか、効率のいいコンピを作るか、ですかね。 Harmoniaさんのコメントの通り提供元では扱えているわけですので情報を聞くとか、可能ならDB3.1の入手を試みるのもおすすめしたいです。

(無題) 削除/引用 No.2334-19 - 2013/11/02 (土) 02:19:48 - sasa 質問に便乗させていただきます。 私もccdbありのコンストラクトを使って実験しているのですが、遺伝子の切り貼りをしようと先日ライゲーションしたのですが全くコロニーが形成されませんでした。 ccdb survival 2T1R(invitrogen)を使っています。 ccdbありのベクターを片方は突出末端、もう片方は平滑末端になる制限酵素で切って、脱リン酸化処理を行いました。 インサートは制限酵素つきのプライマーを使ってPCRで拾ったあと、それぞれの酵素で処理を行い、ライゲーション、ccdb survivalを入れヒートショック後数分氷冷後SOCを加えて37度で1h振とうし、amp+ChloramphenicolのLBプレートに全量まきました。 平滑末端のライゲーションは突出末端同士のライゲーションに比べてライゲーション効率が落ちるといったことは話として聞いたことがありますが、上記と同様の酵素処理したライゲーション（ccdbをもたないベクター）では問題なくライゲーション出来ていたので酵素処理出来ていないという可能性は除去できていると考えています。 通常のべベクターにはDH5alphaを使っていますが、ccdbに用いるコンピではうまくいかない印象があります。コンピテンシーはDH5alphaに比べてかなり悪い印象です（正確に調べていません、スミマセン。。。） コンピテンシーが悪いのならその分ライゲーションに使用するDNA量を増やすことで改善されるのでしょうか？ みなさん、ccdbありのベクターに適当な遺伝子を切り貼りする際、どのような手法、プロトコールで実験されていますでしょうか？ それともみなさんはDH5alphaのように全く同じ操作でライゲーションも全く問題なく出来ているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2334-18 - 2013/11/01 (金) 21:08:47 - Harmonia もらったものなら、プラスミドを送った研究室では増えたのだろうから、 DNAでなく、菌で送りなおしてもらったら？ 組換え体の手続きが、お互いに面倒でないなら。

(無題) 削除/引用 No.2334-17 - 2013/10/30 (水) 09:52:37 - Aa Paさん 非常に勉強になります。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2334-16 - 2013/10/30 (水) 00:44:36 - pa レンチというならLTRはあるだろうと思って確認していなかったのですが、マップを見ますと、LTRとは書いてないですがR, U5, delU3 と表記されているあたりがLTR配列のようです。 http://www.brc.riken.jp/lab/cfm/Subteam_for_Manipulation_of_Cell_Fate/Plasmid_List_files/CS-RfA-CG%20map.pdf http://en.wikipedia.org/wiki/Lentivirus ですのでLTRはありますので、やはり３０度が安心かと思います。自分ならできるだけ30度でやると思います。 プラスミドの大きさが大きいと形質転換効率が下がるというのは私も習いました、そうだろうと思います。

(無題) 削除/引用 No.2334-15 - 2013/10/25 (金) 18:18:25 - Aa >>paさん 勉強不足で教えてください。 CS-RfaシリーズはLTRを持たないですが３０度で振盪したほうがよろしいのでしょうか？ レンチベクターは大きいからヒートショック時に取り込まれにくい、 またLTRが理コンビネーションを起こすため３０度で振った方が理コンビネーションを割けやすいと習いましたが。。。

(無題) 削除/引用 No.2334-14 - 2013/09/01 (日) 18:44:46 - pa 問題なさそうなら大丈夫だと思います。 コンストラクトによって、増殖が遅いということはわりとあることだと思ってます。 私も最後確認するまで不安だったりしますが、だいたいは大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.2334-13 - 2013/09/01 (日) 18:07:30 - ccdb遺伝子 MPさん、paさん 貴重なご意見ありがとうございます。 one O/Nでなく、two O/Nで増えた大腸菌でも全く問題ないという考えでよろしいのでしょうか？実際にベクターを精製して酵素カット、電気泳動で確認し、ベクター自体に問題なさそうであればtwo O/Nで今後ベクターを増やせばいいのかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.2334-12 - 2013/08/30 (金) 21:04:51 - pa レンチのベクターなのですね。 でしたらccdB以上に、そちらのほうが取扱いに注意が必要かもしれないです。 30度で、クロラムフェニコールを使って、増殖が遅いですから通常より長く待つ必要があります。収量も少なめです。 注意点などは配布元からも一般的な情報としてもすぐ見つかると思います。 菌株は、私は幸いアクセスがあるのでDB3.1を使用してます。 理研のベクターの情報を見ますと、DB3.1またはsurvival株と記載があるので、survival株で大丈夫みたいですね。ただ増殖は遅くなりそうです。 自分の記憶だけでいま見つけられないのですが、インビトロジェンの日本語のページで、レンチのデストの調製には現行株よりDB3.1が(入手可能なら)推奨、という記載をみた記憶があります。DB3.1は、EUの組換え生物規制の影響でとりあつかいが無くなったようで、性能自体は現行株より優れているのかなと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.2334-11 - 2013/08/30 (金) 10:12:38 - MP CS-RfAシリーズは確かに増えは悪いですが、、、とくに問題を感じたことはありません。 プレートにも液体培地にもCPは入れるべきです。 O/Nでは濁るところまで増えないかも。もうちょっと粘って培養してみたらいかがでしょう？ ただ最近はつかってないのでpaさんのいうversionの問題もあるのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.2334-10 - 2013/08/30 (金) 09:49:39 - ccdb遺伝子 Harmoniaさん ありがとうございます。 そちらの手法も一度試してみたいと思います。 まだ私のラボではccdB遺伝子を持ったベクターの増幅に関して知識が乏しく上手く行っていない状態ですので、皆様の経験等をお聞かせいただければと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2334-9 - 2013/08/30 (金) 09:47:12 - ccdb遺伝子 paさん ベクターは理研のCS-RfAシリーズです。 皆さんが使用されている大腸菌株はinvitrogenのccdB耐性株なのでしょうか？ DB3.1株の方が現行の株より良いと聞いたことがありますが、もう製造中止で入手できずにいますが。

(無題) 削除/引用 No.2334-8 - 2013/08/30 (金) 08:28:56 - Harmonia プレートに生えたコロニーをかき集めては？ コロニーが生えたということですから、そこまではプラスミドが増幅 できていたのだと思います。 プラスミドDNAを得たら、一度、フェノール抽出をして、再度、形質 転換に使ってみてください。 もらったプラスミドで増えが悪い時、そうすることで改善されたこ とを経験しています。

(無題) 削除/引用 No.2334-7 - 2013/08/30 (金) 03:12:07 - pa こちらこそ、でしゃばったわりにたいしたことを言えず恐縮です。 ccdBに耐性の菌が必要であるほかは、いつものクローニングと変わりないということでいいと思います。 あまりありそうではありませんが、他に思いつくこの系特有の可能性として、 最初の文によると、conversion kitではなくccdb耐性菌コンピの単品を購入されてますが、使われたRfAがもし古いキットのものだったなら、現在売られている耐性株では使えない可能性があります。ccdBベクターと耐性株のシステムは一度マイナーチェンジがありまして、現システムでは耐性株の耐性が以前より低く、それにあわせてベクターのccdB発現が低く抑えてあるそうです。ので、旧システムのccdB高発現ベクターは今の株では増やせないと思います。 あとは、Destにしようとしているベクターに大腸菌での強いプロモーター活性があったら、ccdBの発現を増強してやはり耐性株の限界を超えてしまうことがあるかもしれないです。

(無題) 削除/引用 No.2334-6 - 2013/08/29 (木) 22:20:08 - ccdb遺伝子 >[Re:4] paさんは書きました : > 生えないパターンについては、クロラムフェニコールで改善はできないです。 > どこかのステップに問題があったか、何か操作を間違ったかだと思います。 > > 一点思い浮かぶのは、ccdB耐性じゃない大腸菌を使ったのではないかということです。ccdB Survivalの株を使ったのでしたらこの点は大丈夫ですが。 操作は間違っていません。 何度か試しましたので。 普段、DH5αのようなコンピでベクターを増やすのと同じようにbbdB耐性コンピを使えばRfAベクターも特別な操作が必要というわけでなく、簡単に増やせるということですよね。 大腸菌のインキュベーション温度は25-30℃に変更したら改善されることがあるという書き込みもあるようですし、一度その手法も試そうかと思います。 ただ、コロニーが出来ない場合は根本的にベクターやコンピ自体がおかしい気がしてなりません。 すみません、せっかく色々アドバイスをいただいたのに

(無題) 削除/引用 No.2334-5 - 2013/08/29 (木) 22:17:36 - pa すみません、見落としていました。 LB-ampにコロニーを植えても増えないというのは、クロラムフェニコールは関係ないですね。クロラムフェニコールでは問題は解決しなさそうです。 RfAと呼ばれているのはインビトロジェンのキットに含まれてるDNA断片ですよね。 ccdBとCm耐性が載っているDNA断片というだけで特に特殊な事情があるというものではないので、クローニングの一般的なトラブルシューティングで対応できるかとは思います。。

(無題) 削除/引用 No.2334-4 - 2013/08/29 (木) 22:01:07 - pa 生えないパターンについては、クロラムフェニコールで改善はできないです。 どこかのステップに問題があったか、何か操作を間違ったかだと思います。 一点思い浮かぶのは、ccdB耐性じゃない大腸菌を使ったのではないかということです。ccdB Survivalの株を使ったのでしたらこの点は大丈夫ですが。

(無題) 削除/引用 No.2334-3 - 2013/08/29 (木) 20:32:08 - ccdb遺伝子 paさん クロラムフェニコール耐性遺伝子確かにあります。 アドバイスの通り、一度試してみます。 本当にありがとうございます。 もう一点教えてほしいのですが、あるベクター（Amp）にRfAをライゲーションさせたとき、コロニーが全く生えて来なかったのですが、これもクロラムフェニコールを入れた培地およびLBプレート（AMP+クロラムフェニコール）を使用すればコロニーが出来てくるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2334-2 - 2013/08/29 (木) 19:33:01 - pa RfAを持たない空ベクターのコロニーを拾ってしまっているのだと思います。 RfAにはccdBと一緒にクロラムフェニコール耐性マーカーが載ってますから、プレートにAmpと一緒にクロラムフェニコールを加えればコロニーはほぼ全て当たりになると思います。

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