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HUVEC　siRNA トランスフェクション トピック削除
No.2325-TOPIC - 2013/08/26 (月) 22:22:15 - 8月も終わりか．．．
細胞バンクからHUVECを購入し、Lipofectamine 2Kで
siRNAをトランスフェクションしたのですが、
ノックダウン効率が芳しくありませんでした。、
今度はLipofectamine RNAimaxを用いてトランスフェクションし、
目的の遺伝子をノックダウンしたいと考えています。


siRNAのトランスフェクションの実験書等みてみると
細胞の継代数が少ないものを用いる方がよいと記載されています。
細胞バンクでは継代数を重ねた細胞ですが、
タカラではHUVECの初代細胞を販売しています。

タカラでHUVECを買った方がノックダウン効率がよくなるものなのなのでしょうか。

使用経験があるかたいらっしゃいましたら、ご助言お願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.2325-5 - 2013/09/05 (木) 14:08:24 - 8月も終わりか．．．
あつい、ぺーぺー魚屋さん、名無し　さん

ご助言ありがとうございました。

使用したRNAiは、論文に記載されていた配列で
当施設でもHUVEC以外の正常細胞において標的遺伝子の
発現をノックダウンすることがわかっています。

また、ポジコンとして市販されているb-actinのsiRNAを購入し、
トランスフェクションがワークしているか
トランスフェクション後、48時間目のmRNA発現を指標にしております。

HUVECへのsiRNAトランスフェクションに関しては、
論文でLipofectamine2Kでやっている論文がありましたので
今回実施してみたわけですが．．．。
他の論文も検索すると同時に、細胞は新たに購入せず、
RNAimaxでも条件検討してみます。

(無題) 削除/引用
No.2325-4 - 2013/08/31 (土) 16:57:02 - 名無し
細胞にもの入れる実験は細胞の種類により至適な条件がいろいろ違うことがある（増殖状態とか、トランスフェクション試薬との相性）から、一般的なこと書いてある実験書とかトランスフェクション試薬の説明書だけでなく、実際にHUVECでsiRNAでKDしたというデータの載ってる論文を探して参照した方がいいんじゃないかな。でもたいていは細かい事は書いてない事多いから、直にコレスポにメールして聞くことも必要かもしれない。たいていは親切にいろいろ教えてくれるよ。

あとsiRNA処理してから発現の状態をウェスタンでどのくらいの間隔で何時間／何日くらいまで見てる？半減期長い蛋白質だと減るまで時間かかるから長くみないと。

(無題) 削除/引用
No.2325-3 - 2013/08/28 (水) 12:01:47 - あつい
よく分かりませんが、確かにポジティブコントロールは重要だと思います。
ぺーぺー魚屋さんさんが書いておられるように実績のある配列を使っておられるのでしょうか？

>細胞の継代数が少ないものを用いる方がよいと記載されています。
確かに良く書かれていますが、一般論であって、トランスフェクションのために重要ということでは無いんじゃないでしょうか。実験に用いる細胞の性質の維持（同一性）のために継体数を多くしすぎないことが重要なのではないでしょうか？購入後、何回まで継体すると決めておくことによって、ラボ内である程度の性質の維持ができるのではないかと思います。継体数を重ねることによってトランスフェクションの効率が下がることがあるのであれば、逆に上がることもありえると思うのですが。

実績…… 削除/引用
No.2325-2 - 2013/08/28 (水) 01:18:47 - ぺーぺー魚屋さん
使われている配列が過去に実績があってその時と比べて著しく効率が良くないということでしょうか？
購入するとなると高価なものなので、材料の影響も心にとめておいても、最初に手技的な問題がないかとかを先に考えたほうがいいのじゃないでしょうか。

研究室に実績のある配列があるのならば、それで試されては？

HUVEC　siRNA トランスフェクション 削除/引用
No.2325-1 - 2013/08/26 (月) 22:22:15 - 8月も終わりか．．．
細胞バンクからHUVECを購入し、Lipofectamine 2Kで
siRNAをトランスフェクションしたのですが、
ノックダウン効率が芳しくありませんでした。、
今度はLipofectamine RNAimaxを用いてトランスフェクションし、
目的の遺伝子をノックダウンしたいと考えています。


siRNAのトランスフェクションの実験書等みてみると
細胞の継代数が少ないものを用いる方がよいと記載されています。
細胞バンクでは継代数を重ねた細胞ですが、
タカラではHUVECの初代細胞を販売しています。

タカラでHUVECを買った方がノックダウン効率がよくなるものなのなのでしょうか。

使用経験があるかたいらっしゃいましたら、ご助言お願いします。
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