BioTechnicalフォーラム [免疫沈降におけるタンパク質溶出、この方法は正しいか。]

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(無題)

No.2311-5 - 2013/08/21 (水) 21:59:00 - 上司でさえ

まあ、上司でさえも尊敬できるかどうかは分かりませんが。

結局、場合に依るんですが、普通は単純に2のSupを非結合、3でもっとよく洗って４で洗わないで、５を結合画分とすると思います。よく読解できてませんがあなたがたぶん正しい。ただし、2のSupを非結合とできるような十分なIPの系がいりますね。タグでIPできない部分がゼロということ。

ただし、矛盾していますが実験系を詳細に明らかにできない以上、その先輩の言い分も十分考慮しておく必要があると思います。

そもそも、あまり定量的でない方法ですので、その辺もよく考えに入れておくとよいでしょう。（とても多くのコンセンサスが得られている系、現象なら別です。）

(無題)

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No.2311-4 - 2013/08/21 (水) 21:56:05 - ttt

その結合が特異的であるということがコントロールを使ってきっちり示されている限りは問題無いような気がしますが…
AとBとの結合がかなり弱くて、通常の「洗浄」での条件が実質Elutionになってるということですか。言葉遊びのような気がしますが、「洗浄」と言わずに「RIPAを使った弱い条件でElutionを行った」と言い換えればどうでしょうか？
Aが結合する相手の特異性とか、それほどの弱い結合が生理的に意味があるか、というのはまた別な問題かと。
ちなみに「検出限界以下で結合が増強している」というのはどういうことでしょうか？

(無題)

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No.2311-3 - 2013/08/21 (水) 21:34:18 - 独り言

ネガコンがちゃんとしているのであれば、全く問題ない。
タンパク質の結合によっては、塩濃度、界面活性剤などの影響を強くうける場合があるので、それら違いを利用して目的タンパク質の溶出に使用する事は、十分あります。

> 先輩の言い分としては、

「言い分」ではなくて、理由なのではないでしょうか？なぜ先輩を疑うような上から目線的に感じます。

> 私の考えとしては、どのような経緯であれ、
「どのような経緯」というよりも、先輩の試行錯誤もしくはアイデアだと思いますが。
それとも、かなり実験がヘタな先輩だったため、そのような先入観で先輩をみてしまっているのでしょうかね。

(無題)

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No.2311-2 - 2013/08/21 (水) 21:26:32 - qq

＞先輩の言い分としては、
「先輩の説明では、」もしくは、「先任者の言い分としては、」のいずれかです。先輩は、一種の敬語です。「言い分」は、尊敬する人に使いません。

＞私の考えとしては、どのような経緯であれ、結局RIPAでの洗浄液中のBを検出していては、結合を評価しているとは言えないのではないかと思っています。
あなたの言いたいことが理解できません。
それで、あなたはどうすると良いだろうと思っているのですか？
そこを書きなさいよ。

先輩の手法は万全だとは思いませんが、それほど変な方法ではありません。

免疫沈降におけるタンパク質溶出、この方法は正しいか。

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No.2311-1 - 2013/08/21 (水) 19:38:26 - shio

いつも勉強させていただいております。
この度、所属する研究組織を変えて実験を行っているのですが、in vitroのpull down実験(タグ付き精製タンパク質を用いた免疫沈降)において分からない点が生じているためご教授いただきたく、質問をします。

実験は、Fc(human IgG)タグ付加精製タンパク質Aと、組織溶解液中のタンパク質Bと結合の刺激依存的な検討することを目的としています。先輩の結果の再現取得のようなものなのですが、先輩から教わった以下の方法で果たして本当にデータとして結合を評価してよいのかが疑問です。

1. 刺激を加えない/加えたFc付加タンパク質A(コントロールの場合はFcタンパク質)とprotein G結合磁気ビーズをconjugateする
2. 組織のlysateをビーズ&Fcタグ付加タンパク質Aの複合体に混ぜる
3. マイルドな(detergentの薄い)bufferで2回Wash

ここまではいいのですが、

4. RIPA bufferで2回Wash。そのWash液を集めて回収し、SDS sample bufferを加える。
5. ビーズにSDS sample bufferを加え、98℃ 3分のボイルで溶出する。

このうち4で調整したサンプルを結合を評価したいタンパク質Bの抗体でイムノブロットし、Aに結合しているBとして検出しています。Aのタンパク質は5で調整したサンプルをブロットしてその量を評価しています。

先輩の言い分としては、Wash後にビーズからSDS sample bufferでAごと溶出すると刺激した場合に生じるバックグラウンドがBの分子量と重なる。色々条件を試しても改善しなかったため、強いbufferでAとBを解離させてBを検出している、ということなのですが。。。

私の考えとしては、どのような経緯であれ、結局RIPAでの洗浄液中のBを検出していては、結合を評価しているとは言えないのではないかと思っています。(一応コントロールのFcタンパク質で実験すると4で調整したサンプルでもBは検出されず、Aで沈降するとBが検出されるのですが。)刺激依存的にその結合が増えるか減るかを議論する際に、4でのBの量が減ったから結合が減少したと言っているのですが、むしろRIPAで洗浄したあとに残ったビーズ側においてはブロットの検出限界以下で結合が増強している可能性だってあると思うのですが。。

果たしてこのような方法で結合を論ずることは正しいのでしょうか。私は正しくないと思っていたのですが、組織内の誰もその点を指摘しないため、私が新人という事もあり不安になってしまいました。実際にこのようなプロトコルで実験をした論文も見つかりません。正しくない実験をやらなければいけないのかも、ととにかく不安で仕方ありません。

長文になってしまい申し訳ありませんが、免疫沈降に詳しい方にご教授をいただけると幸いです。よろしくお願いします。

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