全25件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.2311-27 - 2013/08/22 (木) 23:02:30 - 直輝 納得のいく方向性になって良かったですね。 マナー違反というよりは、本人が優秀でも周りとの人間関係がうまくいってないと良い研究はできないから、皆はそういう点を心配してくれたんだと思います。 頑張ってください。

(無題) 削除/引用 No.2311-25 - 2013/08/22 (木) 21:54:54 - shio みなさま、未熟な私の質問にご回答いただきありがとうございます。 ご意見やアドバイスの通り、改めて先輩に対して系に対する懸念点（A-B間の結合強度が逆に増強している可能性など）について質問してみたところ、その点については全く考えていなかった、ということでした。これでは実験系として確かなものではないから、もう一度ビーズからの溶出で評価できるようバックグラウンドが除去できる条件を探すことに注力しよう、ということになりました。 このようなコミュニケーションを避けてこの場で質問したことに対して指摘してくださった方も多くいらっしゃいましたが、本当にその通りで申し訳なく思います。社会人、研究者として最低限のマナーを守りながら、勉強させていただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.2311-23 - 2013/08/22 (木) 21:45:48 - shio >[Re:22] 上司でさえさんは書きました : >自分が納得行かないのなら、バックグラウンドを除去しようとすべきです。Fcということで、もしも抗体関連のシグナル検出のトラブルなら、Fcを他のタグと取り替えるとか。 上司でさえさん、ありがとうございます。私の方で、バックグラウンドが除去できる条件を探してみたいと思います。 >[Re:21] おおさんは書きました : > Bの発現が増えてなくてRIPAフラクションに出てくる量が増えるなら、結合力は強くなっていると評価してもいいかもしれません。あとは皆さんの指摘にほぼ同意です。APさんに一票いれておきます。 おおさん、ご回答ありがとうございます。Ｂの発現は一定で、増えていません。 >[Re:20] monさんは書きました : > 免疫沈降でなく、より定量的な蛍光相関分光法（FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy）が良さそう。 monさん、アドバイスありがとうございます。免疫沈降以外の系にシフトする可能性も十分ありますので、ＦＣＳを利用した分子間相互作用の定量も勉強して考慮に入れたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2311-22 - 2013/08/22 (木) 19:14:57 - 上司でさえ >Wash後にビーズからSDS sample bufferでAごと溶出すると刺激した場合に生じるバックグラウンドがBの分子量と重なる。 画分５にどれだけBがあるかどうか不明なら、それはあまりにもクリティカルにまずいでしょう。 バックグラウンドとは何か？が不明。　あなたは先輩とは独立にそれを確認したのですか？　なんらかの手法でバックグラウンドを除去しようとしましたか？　自分が納得行かないのなら、バックグラウンドを除去しようとすべきです。Fcということで、もしも抗体関連のシグナル検出のトラブルなら、Fcを他のタグと取り替えるとか。 >A-B間を解離させるという系についてのコメントでしょうか。それとも上記していただいた「普通の」IPを含めてのコメントでしょうか。 「普通の」IPです。

(無題) 削除/引用 No.2311-21 - 2013/08/22 (木) 10:43:08 - おお Bの発現が増えてなくてRIPAフラクションに出てくる量が増えるなら、結合力は強くなっていると評価してもいいかもしれません。あとは皆さんの指摘にほぼ同意です。APさんに一票いれておきます。

蛍光相関分光法 削除/引用 No.2311-20 - 2013/08/22 (木) 10:31:26 - mon 免疫沈降でなく、より定量的な蛍光相関分光法（FCS: Fluorescence Correlation Spectroscopy）が良さそう。 原理は、http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/kiki/molecule/fcs/index.htm 材料があれば、デモだけででデータが取れると思う。 タンパク質Bの分子量が大きい方が感度は良いけど、Fc(human IgG)タグ付加精製タンパク質Aを蛍光標識するか、蛍光標識proteinGを使えば。

(無題) 削除/引用 No.2311-19 - 2013/08/22 (木) 09:06:10 - shio >[Re:18] tttさんは書きました : > 最後にサンプルバッファーでの溶出をしてるんですよね？ > その中にBがどれだけあるか確認してて、それでも認められなくて、「検出限界以下」と言うことなのかな？と思ってたのですが。違うのでしょうか？ > 改めてshioさんの情報を見てみるとサンプルバッファーでのeluteだと非特異が強くてBを確認できないということを「検出限界」と表現したのでしょうか？ tttさん、ご返信ありがとうございます。またも説明不足で混乱を招いてしまって申し訳ありません。今回の系では、5の画分にてなんらかのバックがBと重なってしまいBが検出できないという背景があったようです。先ほどの私の回答では、一般的に二者間の結合をこの系で検討することの是非についてが疑問だったため、5でBを見ようとしたときにバックも何も見えない真っ白な状態だったことを仮定して、「検出限界以下」と表現していました。同じA、Bという表記でこの実験特異的な場合と一般的な場合を混同してしまい、申し訳ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2311-18 - 2013/08/22 (木) 08:31:43 - ttt > RIPA bufferでA-B複合体からBを「溶出」させるという系において5のサンプルでＢが検出できなかった場合(すなわちA-B間を全て解離させたように見える場合)でも、4のサンプルで刺激有無を比較してBの検出量が減っていても、5のサンプルでは検出できていないだけでBの量が増えている可能性があるのではないか、という意味でした。すなわち、結合強度が増したためにRIPAでA-B間を解離させる系では、4と5でのBの量変動は逆の動きを示す場合があるのではないかという疑問でした。説明不足で申し訳ありませんでした。 > 最後にサンプルバッファーでの溶出をしてるんですよね？ その中にBがどれだけあるか確認してて、それでも認められなくて、「検出限界以下」と言うことなのかな？と思ってたのですが。違うのでしょうか？ 改めてshioさんの情報を見てみるとサンプルバッファーでのeluteだと非特異が強くてBを確認できないということを「検出限界」と表現したのでしょうか？ と言うか、もし複数のバンドが何本も出てくるようだと抗B抗体の特異性自体にも疑問が出てくるのですが…。 あるいは刺激によってproteolysisとか修飾を受けて分子量が変わったものが強くAに結合して、そうでないものは緩く結合するだけ、とか。あるいは、刺激によって「非特異」がそんなに変わるのなら、刺激によってサンプルバッファーで初めて溶出されるくらいにAに強く結合する“他のタンパク”があって、Bはそれに対して緩く結合してるだけという可能性もあり得ますね。

(無題) 削除/引用 No.2311-17 - 2013/08/22 (木) 08:31:05 - shio >[Re:10] 名無しさんは書きました : 名無しさん、丁寧なご回答ありがとうございます。 > このような場合、protein GビーズとTag-付き 蛋白質 Aを反応させたあとに、適当な架橋剤を使って両者を共有結合させてはずれなくしたものを用いることで、SDS bufferで溶出しても。完全とはいかないまでも相当に混入は減ると思う。 ビーズ成分が混入することを危惧していたようですが、その場合でも架橋剤の使用が有効かもしれません。ありがとうございます、一度確認してみます。 > RIPAで溶出されなくなったら、Bが検出されない＝結合しない、じゃなくてBが検出されない=結合しすぎ、ということで、結果の評価が逆になるからね 私がこの系についての是非を疑問に感じていたのも、この点ゆえでした。もう一度先輩の気分を害さないようにしながら、質問してみようと思います。 > 残念だけどそれがその先生なり先輩のいろんな意味での限界だと思ってる。その人を学問的に尊敬するかどうかとかそういうことはそういう経験を通して自分でゆっくり考えていけばいいのでは。 社会での議論と人間関係のバランスに不安を感じすぎていました。新人のくせに、とこれ以上思われるのを危惧していましたが、あまり深く考えすぎずに過ごしてみたいと思います。biotechnic以外の点もご教授いただき大変勉強になりました、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2311-16 - 2013/08/22 (木) 08:22:34 - shio >[Re:9] 直輝さんは書きました : >刺激した場合に生じるバックグラウンドっていうのは、非特異的な結合によるものなのですか？だとしたら、やっぱりWash不足だと思う。 生じるバックグラウンドの原因は分かっていないようでした。おそらくビーズが何か刺激依存的に悪さをしているのでは、と仰っていました。Wash不足とお答えいただきましたが、Washを強くするなどしてビーズからのA, Bの溶出で結合を議論すべきというご意見でしょうか。 > 例えば、Fcタンパク質をネガコンにしているつもりでも、Fcタンパク質の精製度が高くて（購入試薬）、Fc付加タンパク質Aの精製度が低い（自分で精製）場合なんかは、Fc付加タンパク質Aに含まれている不純物のせいでBが結合したように見えたりします。 ネガコンが同様に精製したものなのか別途用意したものなのかは未確認でした。直樹さん、ありがとうございます。確認させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.2311-15 - 2013/08/22 (木) 08:15:00 - shio >[Re:8] APさんは書きました : > それをすっとばして、こんなところで不満をぶちまけるようなことをするのは不健全だし、研究というもののやり方として間違っているんじゃないかな。 > 研究というのはなにも実験をこなせばいいというものではなくて、ディスカッションも大事な仕事なんじゃないか。 APさん、ありがとうございました。他の実験系や実験計画についても多くを質問していた中で、今回の実験系についても一度意見を述べたときに、私の言い方が悪かったこともあって注意されてしまいました。新人のくせに聞かれたくない部分ばかり聞いてくる、と嫌われてしまうのではないかと危惧して議論を避けてしまっておりましたが、研究者、そして社会人として未熟でした。申し訳ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2311-14 - 2013/08/22 (木) 07:40:33 - shio >[Re:6] モモさんは書きました : > RIPAでの溶出はありでしょう。 > 論文でも見かけたことありますよ。 モモさん、ご回答ありがとうございます。自分の力では、RIPA bufferで洗浄するIPのデータを見つけることはできましたが、RIPA bufferで「溶出」して結合画分としているデータを見つけることができずにいました。論文でみかけたとの情報、ありがとうございます。 > 自分が知らないからと言って先輩を疑うのは感心しませんね。 自分の無知ゆえ、そのような例があればご教授をお願いしたくこの場で質問させていただきました。ご気分を害するような真似をしてしまい申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2311-13 - 2013/08/22 (木) 07:35:44 - shio >[Re:5] 上司でさえさんは書きました : 上司でさえさん、ご回答ありがとうございます。 > 結局、場合に依るんですが、普通は単純に2のSupを非結合、3でもっとよく洗って４で洗わないで、５を結合画分とすると思います。 私もそのようなＩＰが頭に染みついていたため、今回の疑問に至ってしましました。途中でbufferを変えたとしても2、3、4が非結合、5が結合画分としなければいけないのではないか、という疑問です。 > そもそも、あまり定量的でない方法ですので、その辺もよく考えに入れておくとよいでしょう。（とても多くのコンセンサスが得られている系、現象なら別です。） A-B間を解離させるという系についてのコメントでしょうか。それとも上記していただいた「普通の」IPを含めてのコメントでしょうか。理解力不足で申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2311-12 - 2013/08/22 (木) 07:17:16 - shio >[Re:4] tttさんは書きました : > その結合が特異的であるということがコントロールを使ってきっちり示されている限りは問題無いような気がしますが… tttさん、ご回答ありがとうございます。ネガコンが本当に結合negativeなのかあるいは見かけで結合negativeなのか、の区別がつかない可能性を危惧して質問させていただきました。 > ちなみに「検出限界以下で結合が増強している」というのはどういうことでしょうか？ RIPA bufferでA-B複合体からBを「溶出」させるという系において5のサンプルでＢが検出できなかった場合(すなわちA-B間を全て解離させたように見える場合)でも、4のサンプルで刺激有無を比較してBの検出量が減っていても、5のサンプルでは検出できていないだけでBの量が増えている可能性があるのではないか、という意味でした。すなわち、結合強度が増したためにRIPAでA-B間を解離させる系では、4と5でのBの量変動は逆の動きを示す場合があるのではないかという疑問でした。説明不足で申し訳ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2311-11 - 2013/08/22 (木) 07:03:12 - shio >[Re:3] 独り言さんは書きました : > ネガコンがちゃんとしているのであれば、全く問題ない。 > タンパク質の結合によっては、塩濃度、界面活性剤などの影響を強くうける場合があるので、それら違いを利用して目的タンパク質の溶出に使用する事は、十分あります。 ビーズ-A間でなくA-B間を解離させてBを「溶出」させるという系において、ネガコンでBが検出されなかった場合に、ネガコン-Bの結合が強くてBが解離しなかった（つまりネガコンとして機能しなかった）という可能性があるのではないか、と感じておりました。A-B間で解離させる溶出が十分に系としてapproveされているということ、勉強になりました。独り言さん、ありがとうございます。 > 「言い分」ではなくて、理由なのではないでしょうか？なぜ先輩を疑うような上から目線的に感じます。 私の未熟さゆえに言葉を誤りました、申し訳ありません。 >「どのような経緯」というよりも、先輩の試行錯誤もしくはアイデアだと思いますが。 試行錯誤の結果いきついたアイデアについて、先輩も「仕方なく」といった感じの説明をなさっており、この系がapprovableなものかを疑問に思ってしまいました。すみませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2311-10 - 2013/08/22 (木) 03:57:29 - 名無し そんなにこの手の実験の経験多くないんであんまよくわかんないんであれなんだが使えそうな部分あれば参考にして。先輩は溶出物へのTag-付き蛋白質 Aの混入を懸念してRIPAで、とのことだけど、このような場合、protein GビーズとTag-付き 蛋白質 Aを反応させたあとに、適当な架橋剤を使って両者を共有結合させてはずれなくしたものを用いることで、SDS bufferで溶出しても。完全とはいかないまでも相当に混入は減ると思う。これべつに特別なことでなく、先輩が出会ったようなトラブルが起きた時、生化学を多少本腰入れてやっていた人なら大抵のひとは一度は試すと思うんだが、先輩のひとやってみたのかな。聞いてみたら。この時、SDS bufferの溶出だとつよすぎてコンタミナントが増えるから、低pH bufferとか高い塩濃度bufferとかにすればさらに混入減るかもしれない。 RIPA bufferはそんなに強いbufferでないので(実際これでIPも出来ることも多いわけだし）、それで溶出できるなら、比較的弱い相互作用なのかな。Protein GとFcの結合はかなり強固なのでRIPAじゃはずれないだろうからRIPAでBが溶出されるんならこの性質を利用するのは一つのメリットではあるな。ただ気になることは結合した大部分のBがビーズからちゃんと溶出されているかどうかで、これ結構じゅうようかも。ていうのが、刺激でリン酸化とか何か修飾とか、高次構造の変化とかおきたりとかなんかの理由でもしAとBの結合が通常より強さが強まって、RIPAで溶出されなくなったら、Bが検出されない＝結合しない、じゃなくてBが検出されない=結合しすぎ、ということで、結果の評価が逆になるからね、この点はピットホールで要注意とおもうんだが、この点について先輩とか先生とかどんな風に考えてるのかな。 先輩でも先生でも結構初歩的な間違えをしていたり、自分の専門のテーマからちょっとズレると基礎的な知識が不足してることは実際にあるし、これ大丈夫かな？と思ったら（大丈夫じゃない事が多いので）、やっぱあまりあてにせず、自分の眼と頭と手で納得いくまで検証して、実際のデータを前にしてガチで議論するするのがいいとおもう、ていうか昔はともかく今はみんなどこもそうな感じじゃないか？。この議論の際に相手の対応に上下関係を背景にした高圧的なものを感じたら、残念だけどそれがその先生なり先輩のいろんな意味での限界だと思ってる。その人を学問的に尊敬するかどうかとかそういうことはそういう経験を通して自分でゆっくり考えていけばいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.2311-9 - 2013/08/22 (木) 03:16:31 - 直輝 「3. マイルドな(detergentの薄い)bufferで2回Wash」 Washが足りなすぎると感じます。 「Wash後にビーズからSDS sample bufferでAごと溶出すると刺激した場合に生じるバックグラウンドがBの分子量と重なる。」 刺激した場合に生じるバックグラウンドっていうのは、非特異的な結合によるものなのですか？だとしたら、やっぱりWash不足だと思う。 そのような条件でしか検出できないような弱い結合なら、非特異的な吸着と区別がつきにくい。 例えば、Fcタンパク質をネガコンにしているつもりでも、Fcタンパク質の精製度が高くて（購入試薬）、Fc付加タンパク質Aの精製度が低い（自分で精製）場合なんかは、Fc付加タンパク質Aに含まれている不純物のせいでBが結合したように見えたりします。

(無題) 削除/引用 No.2311-8 - 2013/08/22 (木) 00:23:30 - AP あなたの疑問について、その先輩やらラボのメンバーとディスカッションしたのかしら。 「刺激後にBの溶出量が減ったのはBのAに対する結合力が下がって結合量が減ったのではなくて、結合力が強くなったために溶出しにくくなったという解釈も可能だと思いますが、その可能性は排除できるんでしょうか？」と聞いてみて、論議するのが健全なやりかたでしょう。当事者ならではの明確な解答があるのかもしれないし、論議の中から新しいアイデアが生まれてくるかも知れないし。 それをすっとばして、こんなところで不満をぶちまけるようなことをするのは不健全だし、研究というもののやり方として間違っているんじゃないかな。 研究というのはなにも実験をこなせばいいというものではなくて、ディスカッションも大事な仕事なんじゃないか。

(無題) 削除/引用 No.2311-7 - 2013/08/22 (木) 00:03:24 - shio >[Re:2] qqさんは書きました : > 「先輩の説明では、」もしくは、「先任者の言い分としては、」のいずれかです。先輩は、一種の敬語です。「言い分」は、尊敬する人に使いません。 私の言葉使いが間違っておりました。「先輩の説明では、」と訂正させていただきます。未熟でした、申し訳ありません。 > それで、あなたはどうすると良いだろうと思っているのですか？ > そこを書きなさいよ。 刺激依存的にブロットで出現するバックグラウンドがなくなるまで条件を検討し続けてでも（過去にどのような検討がなされていたかについての説明が不十分で申し訳ありません）、ビーズにSDS sample bufferあるいは他の方法で(酸溶出など)ビーズからＡごと溶出しなければならないと思っておりました。（ビーズ-Ａ間でなくＡ−Ｂ間を解離させる系では、刺激有無もしくはネガコンのサンプルを比較してBが検出されない側ではRIPAバッファーでもＡから解離しないほど強く結合している、という解釈もできてしまうのではないか、と思ったからです。)バックグラウンドがなくなる条件が見つからないのであれば、このタグによる本IP実験系を諦めるしかないのでは、と思っておりました。 > 先輩の手法は万全だとは思いませんが、それほど変な方法ではありません。 qqさん、勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2311-6 - 2013/08/21 (水) 22:07:16 - モモ RIPAでの溶出はありでしょう。 論文でも見かけたことありますよ。 自分が知らないからと言って先輩を疑うのは感心しませんね。

全25件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---