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アドバイスできるほどの経験はないのですが 削除/引用 No.2307-10 - 2013/08/23 (金) 16:56:14 - しまなみ 　スクロース浸透に、スターラー回転は、イケると思います。経験があります。シェーカーで揺すってもイイのではないかと思います。 　脳の軟膜等がひらひら脳の表面にまとわりついていませんか？ そういう構造が、スクロース浸透に時間を要する原因になっているように感じたことがあります。ＰＦＡは潅流固定で送り込んでいますけど、スクロースは表面からの拡散だけですから。私は、脳出しが上手？になってから、やけにスクロースに沈みにくくなって、できた切片の表面に軟膜等が残っているのに気がついて、その要素を考えています。 　切片を作るのが超上手な人の場合は、スクロースがろくに浸透していない＝浮いている標本でも、なかなか綺麗にスライスできてしまうようですが、私は、浮いている標本ではスライス時の砕けっぷりが激しくて、元のプロトコル（沈むまで2日待つ）に戻しました。

(無題) 削除/引用 No.2307-9 - 2013/08/21 (水) 17:36:43 - しゅーろん >組織さん: > 固定を長くすると、今度は抗原性が低下する可能性があります（ただしケースバイケース）。2日くらいなら問題なさそうな気もしますが、固定を長くするくらいなら、後固定前に切り出しして組織を小さくする方がいい気がします。 > もしブロックを作ってあるなら、まず一度目的の染色を試してみるのがいいと思います。問題がなければ、わざわざプロトコールを変えなくてもいいんじゃないでしょうか。 わかりました。何度もありがとうございます。 染色は大丈夫みたいなので、後固定前に切り出して1日のままで行おうと思います。

(無題) 削除/引用 No.2307-8 - 2013/08/21 (水) 17:03:47 - 組織 固定を長くすると、今度は抗原性が低下する可能性があります（ただしケースバイケース）。2日くらいなら問題なさそうな気もしますが、固定を長くするくらいなら、後固定前に切り出しして組織を小さくする方がいい気がします。 もしブロックを作ってあるなら、まず一度目的の染色を試してみるのがいいと思います。問題がなければ、わざわざプロトコールを変えなくてもいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2307-7 - 2013/08/21 (水) 15:57:11 - しゅーろん >組織さん > 後固定は脳を丸ごと、4度で1晩浸けてました。 ありがとうございます。 大型ラットの脳の場合、2晩くらい置いた方が良いということはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2307-6 - 2013/08/21 (水) 15:47:57 - 組織 後固定は脳を丸ごと、4度で1晩浸けてました。

(無題) 削除/引用 No.2307-5 - 2013/08/21 (水) 15:27:36 - しゅーろん 組織さん : > 私が大型ラットの脳を扱っていたときは、後固定後に切り出ししてから、30%スクロースに浸漬（4度，数日）してました。それでも完全に沈まないサンプルもありましたが、問題になったことはないですね。 > むしろ固定を気にすべきなのは、染色です。固定が不均一になると、免疫染色で染まりむらが出る可能性があります。 なるほど、染色にむらが出るのですね。 ちなみに、大型ラットの脳を扱っていたときは、後固定の条件はどのように行いましたか？

(無題) 削除/引用 No.2307-4 - 2013/08/21 (水) 13:07:30 - しゅーろん emaさん >あえて後固定４％PFAをのばすくらいですか。PFAの時間あたりの深度浸透率はｍｍ単位だったと思いますので500ｇまるごとって結構大変なような気がします。 > 静置ではなくスターラーを廻し浸透させています。 > 最後の30％で沈めば（浮いてはいけない）充分浸透してOCTに移れる、という風にしています。 ありがとうございます。 スターラーで廻しながらの浸透ですね。 後固定をのばす場合、何日くらいまで置いておくことができますか？ちなみに、500gまるごとではなく、500gのラットの脳を用いています。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2307-3 - 2013/08/21 (水) 12:49:26 - 組織 スクロース置換はそこまで気にしなくてもいいと思いますよ。氷晶による組織構造の崩壊を防ぐための方法ですが、省略してもそこそこの切片は作れます。もし気になるようであれば、1枚HE染色して、実験目的に適う切片かチェックしたらいいです。 私が大型ラットの脳を扱っていたときは、後固定後に切り出ししてから、30%スクロースに浸漬（4度，数日）してました。それでも完全に沈まないサンプルもありましたが、問題になったことはないですね。 むしろ固定を気にすべきなのは、染色です。固定が不均一になると、免疫染色で染まりむらが出る可能性があります。

Sucrose置換 削除/引用 No.2307-2 - 2013/08/21 (水) 09:59:36 - ema マウスの場合ですが、10％の時には浮くこともあります。 固定等の微妙な条件なのでしょうがここで灌流を多少長くして時間をとってもそれに見合うだけの品質変化にはなりません。あえて後固定４％PFAをのばすくらいですか。PFAの時間あたりの深度浸透率はｍｍ単位だったと思いますので500ｇまるごとって結構大変なような気がします。 静置ではなくスターラーを廻し浸透させています。 最後の30％で沈めば（浮いてはいけない）充分浸透してOCTに移れる、という風にしています。

PFA後固定 削除/引用 No.2307-1 - 2013/08/20 (火) 18:13:05 - しゅーろん ラット(400-500g)の脳を灌流固定後、後固定し、10% Sucroseに漬けているのですが、組織が浮く場合と沈む場合があります。 この場合、どちらかの場合でしっかりと固定できていないのでしょうか？ よろしくお願い致します。

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